Padronização de um ensaio imunoenzimático para detecção de vesículas extracelulares plasmáticas em amostras de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico

Registro completo de metadados
MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorCastro, Mauro Jorge Cabral-
Autor(es): dc.contributorSilva , Andrea Alice da-
Autor(es): dc.contributorAvelar, Thalia Medeiros Tito-
Autor(es): dc.contributorVerícimo, Maurício Afonso-
Autor(es): dc.contributorVeríssimo, Giovani Carlo-
Autor(es): dc.contributorSilva Júnior, Haroldo Cid da-
Autor(es): dc.creatorLemos, Ana Patricia de Almeida-
Data de aceite: dc.date.accessioned2025-01-03T11:41:41Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2025-01-03T11:41:41Z-
Data de envio: dc.date.issued2024-08-09-
Data de envio: dc.date.issued2024-08-09-
Fonte completa do material: dc.identifierhttps://app.uff.br/riuff/handle/1/34033-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/919965-
Descrição: dc.descriptionINTRODUÇÃO: As vesículas extracelulares (EVs, do inglês, extracelular vesicles) são pequenas estruturas liberadas de células em condições fisiológicas e patológicas, que carregam DNA, RNA, proteínas, lipídios e metabólitos, atuando na comunicação celular e na resposta imune, com potencial uso como biomarcadores. Sabe-se que pacientes com doenças inflamatórias crônicas, como lúpus eritematoso sistêmico (LES), possuem mais EVs circulantes de diversas origens celulares. Assim, a avaliação das EVs plasmáticas tem grande relevância para o entendimento de seu papel como biomarcadores para prognóstico e acompanhamento tanto no LES, como em outras doenças. Atualmente as EVs são identificadas e quantificadas, principalmente, por citometria de fluxo. Assim, implementar uma técnica de baixa complexidade e custo como o ensaio imunoenzimático permitirá a aplicação da detecção das EVs na área clínica. HIPÓTESE CIENTÍFICA: EVs plasmáticas, originárias de plaquetas (pEVs) e leucócitos (leuEVs), podem ser identificadas por método imunoenzimático, a partir de amostras de plasma de pacientes com LES. OBJETIVO: Padronizar a detecção de EVs plasmáticas por ensaio imunoenzimático a partir de amostras de pacientes com LES. MATERIAL E MÉTODOS: Desenhamos um ensaio imunoenzimático do tipo ELISA de captura para avaliação das pEVs (Anexina V+ CD41+) e leuEVs (AnexinaV+ CD45+). Na padronização avaliamos diferentes concentrações dos anticorpos de captura e secundário, esse marcado com biotina, além da diluição das amostras e do conjugado avidina-peroxidase. Após a padronização, o ELISA foi aplicado frente a um painel de vinte amostras de plasma obtidas de pacientes com LES atendidos no Hospital Universitário Antônio Pedro, além de grupo controle de oito amostras de plasma obtidas de indivíduos sem LES. Os resultados encontrados no ELISA foram analisados frente aos dados obtidos pelo método de referência, a citometria de fluxo. Os parâmetros laboratoriais, os dados clínicos-demográficos e a atividade do LES (classificação SLEDAI-2K) foram obtidos a partir da análise dos prontuários. RESULTADOS: Durante a padronização do ELISA, observamos melhores resultados na diluição das amostras em 1:100, as concentrações de 5 µg/ ml e 4 µg/ ml de anticorpos de captura e secundários, respectivamente; além do conjugado avidina-peroxidase na diluição 1:500. Dos 20 pacientes analisados, 80% eram do sexo feminino, com idade média de 41 (± 12) anos, dos quais 80% faziam uso de prednisona e 65% de hidroxicloroquina. Detectamos as EVs plasmáticas através do ELISA, com sensibilidade e especificidade de 75% e 62% para pEVs e 89% e 50% para leuEVs. Observamos que as amostras dos pacientes com LES apresentaram contagens mais elevadas de pEVs (p=0,001) e mais baixas de leuEVs (p=0,03) quando comparados ao grupo controle. Não observamos diferenças (p > 0,05) quando analisamos a detecção de EVs de acordo com o SLEDAI-2K e concentrações circulantes dos componentes séricos C3 e C4 do sistema complemento e anti-dsDNA. CONCLUSÃO: Detectamos EVs plasmáticas através do ELISA com sensibilidade e especificidade comparáveis à citometria de fluxo. Identificamos que pacientes com LES apresentam alterações nos níveis de EVs plasmáticas, independente da atividade da doença, sugerindo que essas EVs podem ser marcadores precoces de inflamação ou lesão celular.-
Descrição: dc.descriptionINTRODUCTION: Extracellular vesicles (EVs) are small structures released from cells under physiological and pathological conditions, which carry DNA, RNA, proteins, lipids and metabolites, acting in cell communication and immune response, with potential use as biomarkers. It is known that patients with chronic inflammatory diseases, such as systemic lupus erythematosus (SLE), have more circulating EVs of various cellular origins. Thus, the evaluation of plasma EVs is of great importance for understanding their role as biomarkers for prognosis and monitoring both in SLE and in other diseases. EVs are currently identified and quantified mainly by flow cytometry. Thus, implementing a low-complexity, low-cost technique such as the enzyme-linked immunosorbent assay will allow the detection of EVs to be applied in the clinical field. SCIENTIFIC HYPOTHESIS: Plasma EVs, originating from platelets (pEVs) and leukocytes (leuEVs), can be identified by immunoenzymatic method from plasma samples of patients with SLE. OBJECTIVE: To standardize the detection of plasma EVs by enzyme-linked immunosorbent assay using samples from patients with SLE. MATERIAL AND METHODS: We designed a capture ELISA-type immunoassay for the evaluation of pEVs (Annexin V+ CD41+) and leuEVs (Annexin V+ CD45+). For the standardization stage, different concentrations of the capture antibody and the biotin labelled secondary antibody were evaluated, as well as the dilution of the samples and the avidin-peroxidase conjugate. After standardization, the ELISA was applied to a panel of 20 plasma samples obtained from patients with SLE treated at the Antônio Pedro University Hospital, as well as a control group of eight plasma samples obtained from individuals without SLE. The ELISA results were analyzed against the data obtained by the reference method, flow cytometry. Laboratory parameters, clinical demographic data and SLE activity (SLEDAI-2K classification) were obtained from the analysis of medical records. RESULTS: During the standardization of the ELISA, we observed better results when the samples were diluted 1:100, with concentrations of 5 µg/ml and 4 µg/ml of capture and secondary antibodies, respectively; in addition to the avidin-peroxidase conjugate at a dilution of 1:500. Of the 20 patients analyzed, 80% were female, with a mean age of 41 (± 12) years, 80% of whom were taking prednisone and 65% hydroxychloroquine. We detected plasma EVs using ELISA, with sensitivity and specificity of 75% and 62% for pEVs and 89% and 50% for leuEVs. We observed that the samples from SLE patients had higher counts of pEVs (p=0.001) and lower counts of leuEVs (p=0.03) when compared to the control group. We observed no differences (p > 0.05) when we analyzed the detection of EVs according to SLEDAI 2K and circulating concentrations of serum components C3 and C4 of the complement system and anti-dsDNA. CONCLUSION: It was possible to detect plasma EVs using ELISA with sensitivity and specificity comparable to flow cytometry. We identified that patients with SLE show changes in plasma EV levels, regardless of disease activity, suggesting that these EVs may be early markers of inflammation or cell damage.-
Descrição: dc.description96 f.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Idioma: dc.languagept_BR-
Direitos: dc.rightsOpen Access-
Direitos: dc.rightsCC-BY-SA-
Palavras-chave: dc.subjectBiomarcador-
Palavras-chave: dc.subjectELISA-
Palavras-chave: dc.subjectlúpus eritematoso sistêmico-
Palavras-chave: dc.subjectvesículas extracelulares-
Palavras-chave: dc.subjectLupo eritematoso-
Palavras-chave: dc.subjectELISA-
Palavras-chave: dc.subjectBiomarcadores-
Palavras-chave: dc.subjectVesículas Extracelulares-
Palavras-chave: dc.subjectProdução intelectual-
Palavras-chave: dc.subjectBiomarker-
Palavras-chave: dc.subjectextracellular vesicles-
Palavras-chave: dc.subjectELISA-
Palavras-chave: dc.subjectsystemic lupus erythematosus-
Título: dc.titlePadronização de um ensaio imunoenzimático para detecção de vesículas extracelulares plasmáticas em amostras de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico-
Tipo de arquivo: dc.typeDissertação-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense - RiUFF

Não existem arquivos associados a este item.