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Desenvolvimento de sistemas de regulação da expressão gênica em leveduras baseados em optogenética e no uso de serina integrases
Use este link compartilhar ou citar este material: http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/901996
Registro completo de metadados
| Metadados | Descrição | Idioma |
|---|---|---|
| Autor(es): dc.contributor | Reis, Viviane Castelo Branco | - |
| Autor(es): dc.contributor | Torres, Fernando Araripe Gonçalves | - |
| Autor(es): dc.creator | Pérez, Ana Laura Alfonso | - |
| Data de aceite: dc.date.accessioned | 2024-10-23T16:11:19Z | - |
| Data de disponibilização: dc.date.available | 2024-10-23T16:11:19Z | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2024-01-23 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2024-01-23 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2024-01-23 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2023-03-09 | - |
| Fonte completa do material: dc.identifier | http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47481 | - |
| Fonte: dc.identifier.uri | http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/901996 | - |
| Descrição: dc.description | Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2023. | - |
| Descrição: dc.description | A levedura Komagataella phaffii (Pichia pastoris) tem sido utilizada como uma plataforma de produção de proteínas heterólogas há mais de 20 anos por apresentar níveis elevados de expressão gênica pelo uso do promotor do gene AOX1 (PAOX1) induzido por metanol, dentre outras vantagens. Entretanto, o metanol, indutor químico, é tóxico e inflamável. Nos últimos anos, a optogenética tornou-se uma ferramenta muito utilizada para a regulação de processos biológicos, como: expressão gênica, localização de proteínas, transdução de sinais e interações proteína-proteína. Baseia-se na utilização da luz, um indutor físico, para o desenvolvimento de sistemas reguláveis. A aplicação de um circuito optogenético em K. phaffii para a regulação da expressão gênica permite utilizar um sistema induzido que não afeta o metabolismo da levedura e nem sofre interferência do metabolismo celular. No presente projeto, buscamos pela primeira vez o desenvolvimento de um circuito optogenético na levedura Komagataella phaffii responsivo a luz vermelha utilizando o fator de transcrição Mit1, presente na regulação do promotor do AOX1 como um dos componentes do sistema. Esse sistema foi baseado na interação responsiva à luz vermelha de proteínas de fusão que se ligam ao promotor PAOX1. O sistema optogenético foi construído com sucesso requerendo, todavia, ajustes metodológicos para sua implementação. Outro sistema de regulação estudado neste trabalho foi baseado no uso de integrases, uma classe de proteínas virais que mediam a integração e a excisão dos fagos no genoma. Recentemente, foram caracterizadas 11 integrases ortogonais e não há relatos de sua utilização na construção de circuitos na levedura Saccharomyces cerevisiae até o momento. Esta levedura é reconhecida como modelo para o estudo da biologia dos organismos eucariotos, sendo um dos microrganismos mais estudados e caracterizados. Após analises de ortogonalidade, foi feita a análise funcional da integrase 13, junto com a integrase 4 sob o controle do promotor responsivo a galactose. Estas integrases apresentaram a capacidade de ativar o dispositivo genético abrindo caminho para sua utilização como novas ferramentas moleculares para o desenvolvimento e construção de circuitos sintéticos. Por último, foi combinado o sistema de regulação com as integrases com o sistema optogenético com o objetivo de ter um sistema duplamente regulado. O sistema final obtido apresentou-se funcional necessitando ainda ajustes nas condições de exposição à luz vermelha/escuridão. | - |
| Descrição: dc.description | The yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris) has been used as a platform for heterologous protein production for over 20 years because it has high levels of gene expression using the methanol-induced AOX1 (PAOX1) gene promoter, among other advantages. However, methanol, the chemical inducer, is a flammable solution. In recent years, optogenetics has become a widely used tool for the regulation of biological processes such as gene expression, protein localization, signal transduction and protein-protein interactions. Optogenetics is based on the use of light, a physical inducer, to construct regulable systems. The application of an optogenetic circuit in K. phaffii for the regulation of gene expression allows the use of an induced system that neither affects the yeast metabolism nor suffers interference from cellular metabolism. In the present project, we seek for the first time the development of an optogenetic circuit in the yeast Komagataella phaffii responsive to red light using the Mit1 transcription factor, present in the regulation of the AOX1 promoter as one of the components of the system. The optogenetic system obtained is still under adjustment, but this first approach brings us closer to the study of optogenetics in our research group. Another regulatory system is based on the use of integrases, a class of viral proteins that mediate phage integration and excision into the genome during the lysogenic and lytic life cycle. Recently, 11 orthologous integrases have been characterized and there are no reports of their use in circuit construction in the yeast Saccharomyces cerevisiae to date. This yeast is recognized as a model for studying the biology of eukaryotic organisms, and is one of the most studied and characterized microorganisms. After orthogonality analyses, functional analysis of integrase 13 was performed, along with integrase 4 under the control of the galactose responsive promoter. These integrases showed the ability to activate the genetic device paving the way for their use as new molecular tools for the development and construction of synthetic circuits. Finally, the regulation system with the integrases was combined with the optogenetic system in order to have a dual regulated system. The final system obtained was functional and still requires adjustments in the red light/dark light exposure conditions. | - |
| Descrição: dc.description | La levadura Komagataella phaffii (Pichia pastoris) ha sido utilizada como plataforma para la producción de proteínas heterólogas durante más de 20 años debido, entre otras ventajas, por sus altos niveles de expresión génica mediante el uso del promotor del gen AOX1 (PAOX1), inducido por metanol. Sin embargo, el metanol, un inductor químico, es tóxico e inflamable. En los últimos años, la optogenética se ha convertido en una herramienta ampliamente utilizada para la regulación de procesos biológicos, como la expresión génica, la localización de proteínas, la transducción de señales y las interacciones proteína-proteína. Se basa en el uso de la luz, un inductor físico, para desarrollar sistemas regulables. La aplicación de un circuito optogenético en K. phaffii para la regulación de la expresión génica permite utilizar un sistema inducido que no afecta al metabolismo de la levadura ni sufre interferencias del metabolismo celular. En el presente proyecto, buscamos por primera vez el desarrollo de un circuito optogenético en la levadura Komagataella phaffii que responde a la luz roja e se basa en el factor de transcripción Mit1 presente en el mecanismo de regulación del promotor AOX1. Este sistema se basaba en la interacción sensible a la luz de proteínas de fusión que se unen al promotor PAOX1. El sistema optogenético se construyó con éxito, pero requiere ajustes metodológicos para su aplicación. Otro sistema de regulación estudiado en este trabajo se basó en el uso de integrasas, una clase de proteínas virales que median la integración y escisión del fago en el genoma. Recientemente, se han caracterizado 11 integrasas ortólogas y, hasta la fecha, no existen informes sobre su uso en la construcción de circuitos en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura es reconocida como modelo para el estudio de la biología de los organismos eucariotas, siendo uno de los microorganismos más estudiados y caracterizados. Se evaluó la integrasa 13, junto con la integrasa 4 bajo el control del promotor sensible a galactosa. Estas integrasas mostraron la capacidad de activar el dispositivo genético allanando el camino para su uso como nuevas herramientas moleculares para el desarrollo y construcción de circuitos sintéticos. Por último, el sistema de regulación con integrasas se combinó con el sistema optogenético para disponer de un sistema doblemente regulado. El sistema final obtenido era funcional y aún requiere ajustes en las condiciones de exposición a la luz roja/luz oscura. | - |
| Descrição: dc.description | Instituto de Ciências Biológicas (IB) | - |
| Descrição: dc.description | Departamento de Biologia Celular (IB CEL) | - |
| Descrição: dc.description | Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular | - |
| Formato: dc.format | application/pdf | - |
| Direitos: dc.rights | Acesso Aberto | - |
| Direitos: dc.rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Leveduras | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Biologia sintética | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Optogenética | - |
| Título: dc.title | Desenvolvimento de sistemas de regulação da expressão gênica em leveduras baseados em optogenética e no uso de serina integrases | - |
| Tipo de arquivo: dc.type | livro digital | - |
| Aparece nas coleções: | Repositório Institucional – UNB | |
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