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Análise bioquímica e estrutural de uma endoxilanase recombinante de Humicola grisea var. thermoidea em complexo com ácido ferúlico
Use este link compartilhar ou citar este material: http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/901407
Registro completo de metadados
| Metadados | Descrição | Idioma |
|---|---|---|
| Autor(es): dc.contributor | Freitas, Sonia Maria de | - |
| Autor(es): dc.contributor | Faria, Fabrícia Paula de | - |
| Autor(es): dc.creator | Oliveira, Izadora Cristina Moreira de | - |
| Data de aceite: dc.date.accessioned | 2024-10-23T16:09:55Z | - |
| Data de disponibilização: dc.date.available | 2024-10-23T16:09:55Z | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2024-01-23 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2024-01-23 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2024-01-23 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2023-01-29 | - |
| Fonte completa do material: dc.identifier | http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47486 | - |
| Fonte: dc.identifier.uri | http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/901407 | - |
| Descrição: dc.description | Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2023. | - |
| Descrição: dc.description | Uma endo-1,4-beta-xilanase de Humicola grisea var. thermoidea pertencente à família GH11 foi obtida por expressão em Pichia pastoris e denominada HXYN2. As endoxilanases são as principais hemicelulases comercializadas por serem aplicadas em vários setores industriais. Estudos que buscam compreender a relação estrutura e função destas enzimas são fundamentais para o aumento da eficiência catalítica em diferentes condições visando aplicação biotecnológica racional. A HXYN2 apresenta 227 resíduos de aminoácidos, massa molecular de 23 kDa e é termicamente estável, com maior atividade na faixa de 40-50 °C e pH 5,0-9,0, e temperatura e pH ótimos de 50 °C e 6,0, respectivamente. Nesta faixa de pH a HXYN2 apresenta estrutura estável com discretas mudanças conformacionais, indicadas pelos espectros de emissão de fluorescência com leve deslocamento das bandas de emissão, consistentes alterações nas cadeias laterais dos resíduos de triptofano e/ou de resíduos de aminoácidos que estão no microambiente do triptofano. Os espectros de dicroísmo circular (DC) da enzima em pH 4,0, 6,0, 7,0 e 9,0 apresentaram bandas típicas em comprimentos de onda que correspondem a proteínas com estruturas do tipo folhas beta. As curvas de desnaturação térmica obtidas em pH 6,0, 7,0 e 9,0 mostraram dois estados da proteína, nativa e desdobrada, com temperatura de transição (do inglês melting temperature - Tm) entre 50 e 60 °C. Em pH 4,0, esse ponto foi identificado entre 65 e 70 °C, o que sugere que HXYN2 é mais estável estruturalmente em pH ácido. O efeito de oito compostos fenólicos na atividade da HXYN2 foi avaliado e, dentre estes, o ácido ferúlico (AF) aumentou a atividade enzimática em 75%. Os parâmetros cinéticos indicaram que o AF não alterou a afinidade da enzima pelo substrato de xilana beechwood, mas aumentou a Vmax da reação, a eficiência catalítica e o número de turnover da enzima. Dados de calorimetria de titulação isotérmica (CTI), atenuação de fluorescência e docking molecular mostraram que o AF forma um complexo com a HXYN2 na região aglicona, interagindo com resíduos de triptofano expostos ao solvente e outros resíduos nesta vizinhança, por meio de ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e iônicas. Os valores das constantes de ligação para o complexo HXYN2:AF são dependentes do pH e indicaram afinidade de moderada (em pH 7,0 e 9,0) a forte (em pH 4,0). Na presença de AF, os espectros de fluorescência de HXYN2 mostraram mudanças na posição e intensidade das bandas de emissão dependentes do pH. A estrutura secundária de HXYN2 na presença de AF foi alterada com diminuição da α-hélice e aumento de βturn e estruturas desordenadas. A curva de desnaturação térmica na presença do AF apresentou Tm de 54 °C, indicando menor estabilidade estrutural da HXYN2 na presença deste composto. Os cristais da HXYN2 foram obtidos em diferentes condições de cristalização na etapa de triagem. O refinamento destas condições resultou em cristais de diferentes formas e dimensões. Dois destes cristais foram levados ao Laboratório Nacional de Luz Síncroton – Sirius para coleta de dados de difração de raios X. Os dados de difração foram processados, e os resultados indicaram o grupo espacial P212121 (ortorrômbico), a presença de duas moléculas na unidade assimétrica e resolução de 1,6 Å. A estrutura cristalográfica da HXYN2 foi resolvida por substituição, utilizando como modelo as coordenadas atômicas da estrutura da endoxilanase de Thermomyces lanuginosus (PDB 1YNA), e o refinamento está em andamento. | - |
| Descrição: dc.description | An endo-1,4-beta-xylanase from Humicola grisea var. thermoidea belonging to the GH11 family was obtained by expression in Pichia pastoris and named HXYN2. Endoxylanases are the main commercialized hemicellulases because they are applied in several industrial sectors. Studies that search to understand the relationship between structure and function of these enzymes are fundamental for increasing catalytic efficiency under different conditions, aiming at rational biotechnological application. HXYN2 has 227 amino acid residues, a molecular mass of 23 kDa and is thermally stable, with greater activity in the range of 40-50 °C and pH 5.0-9.0, and optimum temperature and pH of 50 °C and 6.0, respectively. In this pH range, HXYN2 presents a stable structure with discrete conformational changes, indicated by fluorescence emission spectra with slight displacement of emission bands, consistent with changes in the side chains of tryptophan residues and/or of amino acid residues that are in the tryptophan microenvironment. Circular dichroism (CD) spectra of the enzyme at pH 4.0, 6.0, 7.0 and 9.0 showed typical bands at wavelengths that correspond to proteins with β-sheet structures. The thermal denaturation curves obtained at pH 6.0, 7.0 and 9.0 showed two states of the protein, native and unfolded, with a melting temperature (Tm) between 50 and 60 °C. At pH 4.0, this point was identified between 65 and 70 °C, which suggests that HXYN2 is more structurally stable at acidic pH. The effect of eight phenolic compounds on HXYN2 activity was evaluated and, among these, ferulic acid (FA) increased enzymatic activity by 75%. Kinetic parameters indicated that FA did not alter the enzyme's affinity for the beechwood xylan substrate, but increased the Vmax of the reaction, the catalytic efficiency and the enzyme turnover number. Data from isothermal titration calorimetry (ITC), fluorescence quenching and molecular docking showed that FA forms a complex with HXYN2 in the aglycone region, interacting with solvent-exposed tryptophan residues and other residues in this vicinity, through hydrogen bonds, hydrophobic and ionic interactions. Binding constant values for the HXYN2:FA complex are pH dependent and indicated moderate (at pH 7.0 and 9.0) to strong (at pH 4.0) affinity. In the presence of FA, the fluorescence spectra of HXYN2 showed pH-dependent changes in the position and intensity of the emission bands. The secondary structure of HXYN2 in the presence of FA was altered with a decrease in the α-helix and an increase in the β-turn and disordered structures. The thermal denaturation curve in the presence of AF showed a Tm of 54 °C, indicating lower structural stability of HXYN2 in the presence of this compound. HXYN2 crystals were obtained under different crystallization conditions in the screening step. The refinement of these conditions resulted in crystals of different shapes and sizes. Two of these crystals were taken to the National Laboratory of Synchrotron Light – Sirius for the collection of Xray diffraction data. The diffraction data were processed, and the results indicated the space group P212121 (orthorhombic), the presence of two molecules in the asymmetric unit and resolution of 1.6 Å. The crystallographic structure of HXYN2 was obtained by molecular replacement, using the atomic coordinates of the structure of endoxylanase from Thermomyces lanuginosus (PDB 1YNA) as a model, and refinement is in progress. | - |
| Descrição: dc.description | Instituto de Ciências Biológicas (IB) | - |
| Descrição: dc.description | Departamento de Biologia Celular (IB CEL) | - |
| Descrição: dc.description | Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular | - |
| Formato: dc.format | application/pdf | - |
| Direitos: dc.rights | Acesso Aberto | - |
| Direitos: dc.rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Endoxilanase | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Ácido ferúlico | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Enzimologia | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Proteínas - estrutura molecular | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Docking molecular | - |
| Título: dc.title | Análise bioquímica e estrutural de uma endoxilanase recombinante de Humicola grisea var. thermoidea em complexo com ácido ferúlico | - |
| Tipo de arquivo: dc.type | livro digital | - |
| Aparece nas coleções: | Repositório Institucional – UNB | |
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