LAMP colorimétrico específico para a detecção do enfezamento vermelho do milho usando uma região genômica exclusiva

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MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorRossato, Maurício-
Autor(es): dc.creatorEgito, Isabella Cristina Santos do-
Data de aceite: dc.date.accessioned2024-10-23T15:43:36Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2024-10-23T15:43:36Z-
Data de envio: dc.date.issued2024-07-24-
Data de envio: dc.date.issued2024-07-24-
Data de envio: dc.date.issued2024-07-24-
Data de envio: dc.date.issued2023-06-27-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/49145-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/890359-
Descrição: dc.descriptionDissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2023.-
Descrição: dc.descriptionO Brasil se destaca por ser o terceiro maior produtor de milho no mundo, além de possuir autossuficiência no abastecimento nacional. Mesmo com a alta produção, o país possui em toda a sua extensão, condições climáticas que favorecem o ataque de diversos patógenos. O enfezamento vermelho do milho, causado pelo fitoplasma Maize bushy stunt phytoplasma (MBSP), é uma das doenças mais prejudiciais à cultura, diante disso, existe a demanda por métodos de detecção que sejam rápidos e acurados. A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um desses métodos, sendo célere, sensível, com alta especificidade e podendo ser utilizada em análises a campo. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um protocolo de LAMP, através de genômica comparativa, para MBSP em milho. Para desenho dos conjuntos de primers foi utilizada a sequência do genoma completo do MBSP e demais sequencias de outros patógenos no software RUCS. Foi possível identificar 3706 sequencias core únicas, dessas, as 60 mais adequadas foram usadas para o desenho e síntese de três conjuntos de primers que apresentavam os critérios desejados. Uma coleção de 51 amostras de milho com e sem sintomas foram coletadas nos estados do Distrito Federal e Goiás, três dessas tiveram a região do 16S rRNA amplificadas, sequenciadas e confirmadas para a presença do MBSP através de análise filogenética. Para o teste do ensaio LAMP, o conjunto de primers mais promissor, 0_731_10_ID1, juntamente com o Kit Warmstart colorimetric LAMP 2X master mix (NEB) e as amostras positivas para MBSP foram usados para avaliação das melhores condições de reação. A proporção de primers internos e externos 1:4 e temperatura de 65 °C foram consideradas as mais adequadas e empregadas aos demais testes. A coleção de amostras foi testada com o nestedPCR com os primers P1/Tint e R16mF2/R16mR2 e comparada com o ensaio LAMP do presente trabalho. Considerando a presença e ausência de sintomas, ocorreu a confirmação de que as plantas sintomáticas eram positivas para o LAMP em maior proporção que para o nested-PCR. A sensibilidade do ensaio foi avaliada usando o produto de PCR com os primers externos F3/B3 purificado, quantificado e diluído de forma seriada em 10 concentrações. O ensaio LAMP proposto se mostrou sensível detectando até 0,1 de DNA. O uso de material vegetal diretamente na reação foi avaliado na mudança de cor do master mix e também para a inibição da reação. Foi identificado que não existem inibidores no tecido vegetal do milho.-
Descrição: dc.descriptionConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF).-
Descrição: dc.descriptionBrazil stands out for being the third largest corn producer in the world, in addition to having self-sufficiency in national supply. Even with the high production, the country has, throughout its extension, climatic conditions that favor the attack of several pathogens. Maize red stunt, caused by Maize bushy stunt phytoplasma (MBSP), is one of the most harmful diseases to the crop, therefore, there is a demand for detection methods that are fast and accurate. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is one of these methods, being fast, sensitive, with high specificity and can be used in field analysis. The goal of the present work was the development of a LAMP protocol, through comparative genomics, for MBSP in maize. To design the sets of primers, the entire MBSP genome sequence and other sequences of other pathogens were used in the RUCS software. It was possible to identify 3706 unique core sequences, of which the 60 most suitable were used for the design and synthesis of three sets of primers that presented the desired criteria. A collection of 51 samples of corn with and without symptoms were collected in the states of Distrito Federal and Goiás, three of which had the 16S rRNA region amplified, sequenced and confirmed for the presence of MBSP through phylogenetic analysis. For the LAMP assay test, the most promising primer set, 0_731_10_ID1, together with the Warmstart colorimetric LAMP 2X master mix (NEB) Kit and the MBSP positive samples were used to evaluate the best reaction conditions. The proportion of internal and external primers 1:4 and temperature of 65 °C were considered the most adequate and used for all tests. The sample collection was tested with nested-PCR with primers P1/Tint and R16mF2/R16mR2 and compared with the LAMP assay of the present work. Considering the presence and absence of symptoms, there was confirmation that the symptomatic plants were positive for LAMP in a greater proportion than for nested-PCR. Assay sensitivity was evaluated using purified, quantified, and serially diluted PCR product with F3/B3 external primers in 10 concentrations. The proposed LAMP assay proved to be sensitive, detecting up to 0.1 fg µL-1 of DNA. The use of plant material directly in the reaction was evaluated for changing the color of the master mix and also for inhibiting the reaction. It was identified that there are no inhibitors in the maize plant tissue.-
Descrição: dc.descriptionInstituto de Ciências Biológicas (IB)-
Descrição: dc.descriptionDepartamento de Fitopatologia (IB FIT)-
Descrição: dc.descriptionPrograma de Pós-Graduação em Fitopatologia-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Idioma: dc.languagept_BR-
Direitos: dc.rightsAcesso Aberto-
Direitos: dc.rightsA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.-
Palavras-chave: dc.subjectMilho - doenças e pragas-
Palavras-chave: dc.subjectGenoma-
Palavras-chave: dc.subjectColorimetria-
Título: dc.titleLAMP colorimétrico específico para a detecção do enfezamento vermelho do milho usando uma região genômica exclusiva-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional – UNB

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