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Metadados | Descrição | Idioma |
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Autor(es): dc.contributor | Charneau, Sebastien Olivier | - |
Autor(es): dc.creator | Goulart, Paula Marian Vieira | - |
Data de aceite: dc.date.accessioned | 2024-10-23T15:37:53Z | - |
Data de disponibilização: dc.date.available | 2024-10-23T15:37:53Z | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2024-09-03 | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2024-09-03 | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2024-09-03 | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2024-02-07 | - |
Fonte completa do material: dc.identifier | http://repositorio.unb.br/handle/10482/50295 | - |
Fonte: dc.identifier.uri | http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/887929 | - |
Descrição: dc.description | Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2024. | - |
Descrição: dc.description | Os tripanossomatídeos, pertencentes à classe Kinetoplastida e incluindo os gêneros Trypanosoma e Leishmania, são agentes causadores de doenças tropicais negligenciadas que impactam mais de 1,7 bilhão de pessoas em todo o mundo, conforme relatado pela OMS em 2023. Estes parasitos possuem características biológicas únicas, como organelas especializadas e núcleos com uma composição proteica peculiar, diferenciando-os notavelmente de outros eucariotos. Entre as organelas especializadas, o glicossomo se destaca pela diversidade de seu repertório enzimático, essencial para processos metabólicos como a via das pentoses-fosfato, gliconeogênese, via de salvamento de purina, β-oxidação de ácidos graxos e biossíntese de éterlipídios, isoprenóides, esteróis e pirimidinas. As enzimas glicossomais, fundamentais nessas vias, são alvos promissores para o desenvolvimento de medicamentos. No entanto, até o momento, as análises do proteoma dessas organelas foram abordadas por meio de métodos convencionais de enriquecimento, que resultam em uma cobertura limitada das proteínas identificadas. Para superar essa limitação, os métodos de marcação por proximidade têm sido amplamente aplicados para o mapeamento proteômico de diferentes compartimentos subcelulares. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi elaborar uma estratégia de marcação de proximidade baseada em APEX2 para analisar a composição proteica dos glicossomos e do núcleo de Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi. Inicialmente, procedemos com a clonagem da sequência da APEX2, que foi fusionada ao peptídeo de endereçamento glicossômico (PTS1) e ao sinal de localização nuclear (NLS), nos vetores pLEXSY (Leishmania) e pTREX (T. cruzi), adquiridos comercialmente. Paralelamente, como controle, realizamos a clonagem da sequência de mNeonGreen, também fusionada aos mesmos peptídeos. Essa estratégia resultou na criação de um total de oito construções distintas. Após transfecção dos plasmídeos e seleção dos parasitos resistentes à marca de seleção, os diferentes clones foram avaliados quanto à sua expressão e atividade. Os resultados indicaram que as proteínas APEX2 estão abundantemente expressas nos extratos proteicos de ambos os parasitos transfectados com o cassete. Contudo, em relação às proteínas mNeonGreen, observou-se uma expressão reduzida nos extratos proteicos examinados. Adicionalmente, as proteínas APEX2- PTS1 e APEX2-NLS promoveram a biotinilação específica de proteínas nos glicossomos e no núcleo, respectivamente, em L. infantum. Esses resultados revelam a possível viabilidade da aplicação da APEX2 no contexto bioquímico de L. infantum. Como perspectiva, visamos validar a técnica em T. cruzi e realizar uma análise proteômica comparativa entre os dois organismos. Acreditamos que essa abordagem nos permitirá revelar mecanismos de adaptação metabólica empregados por esse grupo de parasitos, além de identificar possíveis alvos farmacológicos para o tratamento das doenças associadas a tripanossomatídeos. | - |
Descrição: dc.description | Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). | - |
Descrição: dc.description | The trypanosomatids, belonging to the Kinetoplastida class and including the genera Trypanosoma and Leishmania, are agents causing neglected tropical diseases that impact more than 1.7 billion people worldwide, as reported by the WHO in 2023. These parasites possess unique biological characteristics, such as specialized organelles and nuclei with a peculiar protein composition, distinctly differentiating them from other eukaryotes. Among the specialized organelles, the glycosome stands out for the diversity of its enzymatic repertoire, essential for metabolic processes such as the pentose phosphate pathway, gluconeogenesis, purine salvage, β-oxidation of fatty acids, and biosynthesis of ether lipids, isoprenoids, sterols, and pyrimidines. Glycosomal enzymes, fundamental in these pathways, are promising targets for drug development. However, to date, analyses of the proteome of these organelles have been approached through conventional enrichment methods, resulting in limited coverage of identified proteins. To overcome this limitation, proximity labeling methods have been widely applied for proteomic mapping of different subcellular compartments. Thus, the aim of this study was to develop a proximity labeling strategy based on APEX2 to analyze the protein composition of glycosomes and the nucleus of Leishmania infantum and Trypanosoma cruzi. Initially, we proceeded with the cloning of the APEX2 sequence, which was fused to the glycosomal targeting peptide (PTS1) and the nuclear localization signal (NLS), in the vectors pLEXSY (Leishmania) and pTREX (T. cruzi). Concurrently, as a control, we performed cloning of the NeonGreen sequence, also fused to the same peptides. This strategy resulted in the creation of a total of eight distinct constructs. After transfection of the plasmids and selection of resistant parasites, the different clones were evaluated for their expression and activity. The results indicated that the APEX2 proteins are abundantly expressed in the protein extracts of both parasites transfected with the cassette. However, in relation to the mNeonGreen proteins, a reduced expression was observed in the examined protein extracts. Additionally, the APEX2-PTS1 and APEX2-NLS proteins promoted specific biotinylation of proteins in the glycosomes and nucleus, respectively, in L. infantum. These results reveal the potential viability of applying APEX2 in the biochemical context of L. infantum. As a perspective, we aim to validate the technique in T. cruzi and carry out a comparative proteomic analysis between the two organisms. We believe that this approach will allow us to reveal metabolic adaptation mechanisms employed by this group of parasites, in addition to identifying potential pharmacological targets for the treatment of diseases associated with trypanosomatids. | - |
Descrição: dc.description | Faculdade de Medicina (FMD) | - |
Descrição: dc.description | Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular | - |
Formato: dc.format | application/pdf | - |
Idioma: dc.language | pt_BR | - |
Direitos: dc.rights | Acesso Aberto | - |
Direitos: dc.rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. | - |
Palavras-chave: dc.subject | Tripanossomatídeos | - |
Palavras-chave: dc.subject | Trypanosoma cruzi | - |
Palavras-chave: dc.subject | Leishmania infantum | - |
Palavras-chave: dc.subject | APEX2 | - |
Palavras-chave: dc.subject | Glicossomos | - |
Título: dc.title | Implementação de um sistema de marcação proteômica organelar por proximidade baseado em APEX2 para glicossomos e núcleos de tripanossomatídeos | - |
Tipo de arquivo: dc.type | livro digital | - |
Aparece nas coleções: | Repositório Institucional – UNB |
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