Caracterização in silico e avaliação da atividade anti-hemostática do antígeno 5 da saliva de Rhodnius neglectus, vetor da doença de Chagas

Registro completo de metadados
MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorAraújo, Carla Nunes de-
Autor(es): dc.contributorSantiago, Paula Beatriz de Medeiros-
Autor(es): dc.creatorVieira, Giulia Causin-
Data de aceite: dc.date.accessioned2024-10-23T15:06:10Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2024-10-23T15:06:10Z-
Data de envio: dc.date.issued2024-07-13-
Data de envio: dc.date.issued2024-07-13-
Data de envio: dc.date.issued2024-07-12-
Data de envio: dc.date.issued2022-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/48834-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/874354-
Descrição: dc.descriptionDissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2023.-
Descrição: dc.descriptionOs triatomíneos são insetos hematófagos transmissores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. Sua saliva é rica em compostos que neutralizam as respostas hemostáticas e imunológicas do hospedeiro. O antígeno 5 (Ag5), membro da superfamília CAP, composta por proteínas ricas em resíduos de cisteína (CRISP - cysteine rich secretory proteins), pelo Antígeno 5 e por proteínas relacionadas à patogenicidade em plantas (Pathogenesis-related – PR1), foi relatado na saliva de artrópodes como responsável por causar fortes respostas alérgicas. Este estudo teve como objetivo caracterizar o antígeno 5 salivar de Rhodnius neglectus (RnAg5) através de abordagens de bioinformática, produzir o RnAg5 recombinante e avaliar seu potencial de inibir a hemostasia. Análises in silico foram realizadas para prever a presença de peptídeo sinal, localização celular e modificações pós-traducionais. A estrutura tridimensional (3D) do RnAg5 foi obtida através do servidor Alphafold, e os aminoácidos que compõem epítopos de células B foram preditos com os servidores ElliPro, BepiPred e SeRenDIP. Com a finalidade de priorizar ligantes promissores, foram realizados cálculos de docking molecular, com o servidor web DockThor. Afim de analisar a relação evolutiva de membros da família Ag5, foi realizada análise filogenética. A sequência Ag5 foi clonada no vetor pET100/D-TOPO e expressa em Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS com isopropil B-D-tiogalactopiranosídeo 1 mM a 37ºC e purificada por cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados. Posteriormente, foram realizados ensaios de coagulação sanguínea e agregação plaquetária na presença do RnAg5 recombinante para avaliar seu potencial inibitório. O RnAg5 demonstrou possuir um peptídeo sinal no N-terminal, sendo putativamente secretado pela via clássica, possuindo sítios de motificação pós-traducional. Visando o RnAg5 como um marcador de exposição a picadas de triatomíneos, foram identificados resíduos de aminoácidos que compõem epítopos lineares e epítopos conformacionais. O docking molecular indicou o fator de ativação de plaquetas, leucotrieno D4 e E4, prostaglandina I2, tromboxano A2 e prostaglandina E2 como potenciais ligantes do RnAg5. O RnAg5 recombinante foi expresso em corpos de inclusão e também na fração solúvel, sendo esse o primeiro estudo em que essa proteína foi expressa na fração solúvel através de sistema heterólogo de expressão procarioto. A expressão da proteína recombinante foi confirmada por western blotting utilizando anticorpo anti-histidina. Apesar do RnAg5 recombinante não ter apresentado atividade anticoagulante ou inibidora da agressão plaquetária nesse estudo, os resultados computacionais abrem perpectivas do seu potencial biotecnológico.-
Descrição: dc.descriptionTriatomines are hematophagous insects that transmit the protozoan Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease. Their saliva is rich in compounds that counteract host hemostatic and immune responses. Antigen 5 (Ag5), a member of Cysteine-Rich Secretory Proteins, Antigen 5 and Pathogenesis-Related 1 Proteins (CAP) superfamily, has been reported in arthropod saliva as responsible for causing strong allergic responses. This study aimed to characterize Rhodnius neglectus salivary antigen 5 (RnAg5) through bioinformatics approaches, produce recombinant RnAg5 and evaluate its potential to inhibit hemostasis. In silico analyzes were performed to predict signal peptide presence, cellular localization and posttranslational modifications. The three-dimensional (3D) structure of RnAg5 was obtained using the Alphafold server, and the amino acids that compose B cell epitopes were predicted using the ElliPro, BepiPred and SeRenDIP servers. In order to identify promising ligands, molecular docking calculations were performed with the DockThor web server. In order to analyze the evolutionary relationship of members of the Ag5 family, phylogenetic analysis was also performed. The Ag5 sequence was cloned into the pET100/D-TOPO vector and expressed in Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS with 1 mM isopropyl B-D-thiogalactopyranoside at 37ºC and purified by immobilized metal ion affinity chromatography. Subsequently, coagulation and platelet aggregation assays were performed in the presence of recombinant RnAg5 to evaluate its inhibitory potential. RnAg5 has been shown to have a signal peptide at the N-terminus, putatively being secreted by the classical pathway, with post-translational motification sites. Aiming for a marker of exposure to triatomine bites, were identified amino acid residues that form linear epitopes and conformational epitopes. Molecular docking indicated platelet activating factor, leukotriene D4 and E4, prostaglandin I2, thromboxane A2 and prostaglandin E2 as potential ligands for RnAg5. Recombinant RnAg5 was expressed in inclusion bodies and also in the soluble fraction, this being the first study in which this protein was expressed in the soluble fraction using a heterologous prokaryotic expression system. Recombinant protein expression was confirmed by western blotting using anti-histidine tag antibody. Although recombinant RnAg5 did not show anticoagulant or platelet inhibitory activity in this study, the computational results open up perspectives on its biotechnological potential.-
Descrição: dc.descriptionFaculdade de Medicina (FMD)-
Descrição: dc.descriptionPrograma de Pós-Graduação em Ciências Médicas-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Idioma: dc.languagept_BR-
Direitos: dc.rightsAcesso Aberto-
Palavras-chave: dc.subjectAntígenos-
Palavras-chave: dc.subjectBioinformática-
Palavras-chave: dc.subjectAnticoagulantes (Medicina)-
Título: dc.titleCaracterização in silico e avaliação da atividade anti-hemostática do antígeno 5 da saliva de Rhodnius neglectus, vetor da doença de Chagas-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional – UNB

Não existem arquivos associados a este item.