Papel filtro como alternativa de coleta de urina na doença de Pompe: desenvolvimento do método para determinação do tetrassacarídeo de glicose e busca por novos biomarcadorres

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MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorMarques, Flávia Ferreira de Carvalho-
Autor(es): dc.contributorCosta, Rafael Garrett da-
Autor(es): dc.contributorDuarte, Lucas Mattos-
Autor(es): dc.contributorCassella, Ricardo Jorgensen-
Autor(es): dc.contributorSussulini, Alessandra-
Autor(es): dc.contributorPereira, Henrique Marcelo Gualberto-
Autor(es): dc.creatorSouza, Hygor Marcos Ribeiro de-
Data de aceite: dc.date.accessioned2024-07-11T18:45:44Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2024-07-11T18:45:44Z-
Data de envio: dc.date.issued2023-05-26-
Data de envio: dc.date.issued2023-05-26-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://app.uff.br/riuff/handle/1/28998-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/777035-
Descrição: dc.descriptionA doença de Pompe é um erro inato do metabolismo caracterizada pelo acúmulo intralisossomal de glicogênio devido à deficiência da enzima α-glicosidase ácida. É uma patologia rara, que pode levar o indivíduo ao óbito logo nos primeiros anos de vida. Dentre os métodos de diagnósticos e ensaios laboratoriais auxiliares já conhecidos, a determinação do biomarcador não-seletivo tetrassacarídeo de glicose (Glc4) por cromatografia a líquido em urina é utilizada como teste secundário e não invasivo na avaliação inicial de um indivíduo com a suspeita da doença. Tal abordagem também é bastante utilizada no monitoramento dos níveis de Glc4 na urina do paciente já diagnosticado e submetido à terapia de reposição enzimática, de modo a avaliar a eficácia da intervenção terapêutica. Contudo, o envio das amostras de urina dos pacientes para o laboratório clínico, quando necessário, é bastante custoso, demorado e crítico, uma vez que essas amostras devem ser necessariamente mantidas sob refrigeração. Dessa forma, foi desenvolvido neste trabalho um kit para coleta da urina em papel filtro para a determinação de Glc4 por LC-HRMS. Este kit permitirá que os usuários coletem a urina em papel de filtro em sua própria casa e enviem para o laboratório via correios em envelope convencional e em temperatura ambiente. Para o emprego da metodologia, 1 mL de urina foi adicionada sobre o papel filtro disposto em uma caixa de plástico (6,0 x 3,0 cm). Após a secagem à temperatura ambiente por 24 h, a extração foi realizada com uma mistura de ACN:H2O (1:1, %v/v) contendo 0,1% de NH4OH sob agitação por 15 min. O extrato foi centrifugado e analisado por LC-HMRS, utilizando experimentos de aquisição de dados de análise alvo para a determinação do Glc4 combinado com análise global para a busca de novos biomarcadores. O método desenvolvido para o Glc4 foi validado e apresentou faixa linear compreendida entre 1-20 μg/mL, LQ de 0,03μg/mL, repetibilidade < 5,11% (n = 9) e recuperação de 96 ± 3,59% em três níveis de concentrações. A metodologia utilizando a urina seca foi confrontada com aquela já estabelecida para a determinação do Glc4 em urina in natura, na qual a estatística de Bland-Altmann confirmou a existência de uma boa relação entre as mesmas (bias: -0,1429; limite de concordância de 95%: -3,001- 2,716). O estudo de estabilidade permitiu verificar a degradação do Glc4, bem como dos demais metabólitos presentes na urina seca a partir do sétimo dia a 4 e 22 °C, e a partir do terceiro dia a 50 ºC. Dados da literatura mostram uma estabilidade de apenas 24 h para urina in natura a 4 e 22 °C. As análises estatísticas multivariadas empregadas para o tratamento de dados de análise global como PCA, PLS-DA, Random Forest e Curva ROC, revelaram diferenças metabólicas entre o grupo Pompe e o controle. O conjunto de potenciais biomarcadores encontrados aumentou a predição na classificação das amostras, assumindo um grande passo para o desenvolvimento de futuros testes de triagem mais específicos e de fácil acesso utilizando urina coletada em papel filtro para a doença de Pompe.-
Descrição: dc.descriptionPompe disease is an inborn error of metabolism caused by the intralysosomal accumulation of glycogen due to α-glucosidase acid enzyme deficiency. It has a significant impact on health and life quality, and may lead to death in the first years of life. Among the well-established diagnostic methods, urinary glucose tetrasaccharide (Glc4) by liquid chromatography has been a helpful biomarker as a secondary tier test and showed an important decrease in patients on enzyme replacement therapy, demonstrating therapy efficacy. However, the shipping process from a sampling location to a laboratory for monitoring the Glc4 is often cooled at low temperatures, poising a costly process and a preanalytical challenge. Thus, a simple methodology for Glc4 quantification in dried urine on filter paper (DUFP) using liquid chromatography-high resolution mass spectrometry was developed. This collection kit will allow users to collect their urine on filter paper at their own home and send it by post mail under usual shipping conditions. For the method development, urine samples were spiked with Glc4 and added on filter papers, which were dried for 24 h on plastic boxes at ambient temperature. The extraction was performed using ACN:H2O 1:1 (%, v/v) containing 0.1 % of NH4OH under agitation for 15 min. The extract was centrifuged and analyzed by LC-HRMS combining targeted and nontargeted experiments. The analytical method developed was successfully evaluated and showed linear range between 1-20 μg/mL, LOQ of 0,03 μg/mL, repeatability < 5,11% (n = 9) and recovery of 96 ± 3,59% considering three concentration levels. For the stability assay the Glc4 as well as other metabolites in DUFP showed stability up to 7 days at 4 and 22 °C, and up to 3 days at 50 °C. Literature data for liquid urine have demonstrated metabolic stability for just 24h at 4 and 22 °C. The results obtained for the determination of Glc4 in dried urine were compared with those obtained in liquid urine specimens using established methodologies. As result, Bland-Altmann statistic confirmed the existence of a powerful relationship between the both methodologies (bias: -0.1429; limit of agreement: -3.001-2.716). Multivariate statistical analyzes such as PCA, PLS-DA, Random Forest and ROC curve approach used for the untargeted analysis data treatment revealed metabolic differences between the Pompe group and control. The panel of potential biomarkers obtained increased sample class prediction by the ROC curve. Thus, dried urine filter paper combined with untargeted metabolomics showed great potential to be used in clinical laboratories for Pompe disease diagnosis.-
Descrição: dc.description156 f.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Idioma: dc.languagept_BR-
Direitos: dc.rightsOpen Access-
Direitos: dc.rightsCC-BY-SA-
Palavras-chave: dc.subjectDoença de Pompe-
Palavras-chave: dc.subjectDoença rara-
Palavras-chave: dc.subjectErro inato do metabolismo-
Palavras-chave: dc.subjectKit-
Palavras-chave: dc.subjectUrina-
Palavras-chave: dc.subjectPapel filtro-
Palavras-chave: dc.subjectTetrassacarídeo de glicose-
Palavras-chave: dc.subjectLC-HRMS-
Palavras-chave: dc.subjectBiomarcadores-
Palavras-chave: dc.subjectBiomarcador diagnóstico-
Palavras-chave: dc.subjectGlucosa tetrasacárido-
Palavras-chave: dc.subjectDeficiência de enzimas-
Palavras-chave: dc.subjectDoença genética-
Palavras-chave: dc.subjectComposto químico-
Palavras-chave: dc.subjectFibra muscular-
Palavras-chave: dc.subjectMetabolismo-
Palavras-chave: dc.subjectCromatografia a líquido de alta eficiência-
Palavras-chave: dc.subjectEspectrometria de massa com acelerador-
Palavras-chave: dc.subjectPompe disease-
Palavras-chave: dc.subjectRare disease-
Palavras-chave: dc.subjectInborn error of metabolism-
Palavras-chave: dc.subjectKit-
Palavras-chave: dc.subjectUrine-
Palavras-chave: dc.subjectFilter paper-
Palavras-chave: dc.subjectGlucose tetrasaccharide-
Palavras-chave: dc.subjectLC-HRMS-
Palavras-chave: dc.subjectBiomarkers-
Título: dc.titlePapel filtro como alternativa de coleta de urina na doença de Pompe: desenvolvimento do método para determinação do tetrassacarídeo de glicose e busca por novos biomarcadorres-
Título: dc.titleFilter paper as an alternative for urine collection in Pompe disease: development of a method for determination of glucose tetrasaccharide and search for new biomarkers-
Tipo de arquivo: dc.typeTese-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense - RiUFF

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