Diagnóstico diferencial da infecção pelo vírus zika e outras arboviroses: produção de proteínas recombinantes com potencial antigênico para o desenvolvimento de métodos imunológicos

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MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorPeralta, Regina Helena Saramago-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/5783552092078548-
Autor(es): dc.contributorPeralta, José Mauro-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/3295118251286153-
Autor(es): dc.contributorAzevedo, Renata Campos-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/9580982491890053    -
Autor(es): dc.contributorCortines, Juliana Reis-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/4809242041040893    -
Autor(es): dc.contributorAlves, Carlos Roberto-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/9011901357649135    -
Autor(es): dc.contributorXavier, Analucia Rampazzo-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/1450682878713091-
Autor(es): dc.contributorSilva, Andrea Alice da-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/4836406900271376-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/3056370422748119-
Autor(es): dc.creatorFreitas, Juliana Torres de-
Data de aceite: dc.date.accessioned2024-07-11T18:29:33Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2024-07-11T18:29:33Z-
Data de envio: dc.date.issued2022-07-07-
Data de envio: dc.date.issued2022-07-07-
Data de envio: dc.date.issued2021-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://app.uff.br/riuff/handle/1/25634-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://dx.doi.org/10.22409/PPG-Patologia.2022.d.35714764846-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/771633-
Descrição: dc.descriptionIntrodução: O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus da família Flaviviridae que causa infecções assintomáticas e sintomáticas. O diagnóstico clínico das arboviroses é dificultado nas áreas com cocirculação do ZIKV, Dengue (DENV) e Chikungunya (CHIKV) e, assim, a confirmação laboratorial baseada na resposta imunológica do hospedeiro é importante, principalmente para gestantes. Hipótese(s) Científica(s): A utilização de proteínas específicas do ZIKV, através da tecnologia recombinante de produção de proteínas, permitirá o desenvolvimento de metodologia sensível e específica no diagnóstico diferencial das principais arboviroses que infectam o ser humano. Objetivo Geral: Produção de proteínas recombinantes virais e desenvolvimento de métodos imunológicos para o diagnóstico diferencial da infecção pelo vírus Zika e outras arboviroses. Objetivo(s) Específico(s): Produzir proteínas recombinantes virais de interesse através de expressão heteróloga utilizando a tecnologia do DNA sintético; avaliar a antigenicidade e imunogenicidade das proteínas expressas frente a amostras de referência de cada um desses vírus, desenvolvimento e padronização de métodos para o diagnóstico diferencial através da detecção de antígenos e anticorpos utilizando as técnicas de ELISA e LUMINEX e avaliar a sensibilidade e especificidade dos métodos imunológicos previamente padronizados utilizando amostras clínicas de pacientes infectados com arbovírus. Material e Métodos: Foram analisadas a antigenicidade e imunogeniciadde in silico das sequências de aminoácidos das proteínas recombinantes. Para padronizar e avaliar os ensaios, foram utilizados soros da soroteca do Laboratório de Diagnóstico Imunológico e Molecular das Doenças Infecciosas e Parasitárias do Instituto de Microbiologia Paulo Góes (UFRJ), que foram testados previamente por RT-PCR para ZIKV, DENV e CHIKV. Foram expressas quatro proteínas parciais recombinates do ZIKV (Envelope, NS3 e NS5) com calda de histidina em seu N-terminal com a utilização de DNA sintético otimizando a sequência gênica. Após expressão, essas proteínas foram purificadas em colunas de níquel por cromatografia de afinidade. O método de ELISA indireto para detecção de IgG foi padronizado utilizando essas proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos das proteínas de Envelope e NS1 no diagnóstico do ZIKV, através da detecção de anticorpos em amostras clínicas. Também foi padronizado um método multiplex (LUMINEX) para diagnóstico do ZIKV utilizando a proteína recENV. Resultados: As análises in silico mostraram que todas as proteínas recombinantes possuem sítios antigênicos. Foi observado uma maior expressão da proteína recNS5, NS31 e 2 em extrato solúvel e da proteína recENV de ZIKV no insolúvel e elas apresentaram peso molecular de aproximadamente 28 kDa, 25 kDa, 25 kDa e 30 kDa, respectivamente. Após sequenciamento por espectrometria de massas, foram comprovadas as sequências corretas das mesmas, com exceção da recNS5 ZIKV, mas com contaminação por peptídeos de E. coli e uma segunda expressão da recENV foi realizada. Um teste ELISA foi padronizado utilizando a segunda recENV ZIKV expressa e uma sensibilidade de 67% e uma especificidade de 96% foi observada. Um estudo de cinética de anticorpos IgM e IgG foi realizado utilizando soros de 8 pacientes em acompanhamento, que mostraram na sua maioria, uma producao esperada de anticorpos. Três peptídeos de ENV ZIKV e um de NS1 ZIKV, apresentaram imunoreatividade quando testados com amostras positivas para ZIKV, DENV e controle negativo. Um teste multiplex Luminex foi realizado utilizando a proteína recENV ZIKV e apresentou diferenciação de soros positivos dos negativos-
Descrição: dc.descriptionCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-
Descrição: dc.descriptionIntroduction: The Zika virus (ZIKV) is an arbovirus of the Flaviviridae family that causes asymptomatic and symptomatic infections. The clinical diagnosis of arboviruses is difficult in areas with co-circulation of the ZIKV, Dengue (DENV) and Chikungunya (CHIKV) virus and, thus, laboratory confirmation based on the host's immune response is important, especially for pregnant women. Scientific hypothesis: The use of specific proteins of the ZIKV, DENV and CHIKV, through recombinant protein production technology, will allow the development of sensitive and specific methodology in the differential diagnosis of the main arboviruses that infect humans. General Objective: Production of recombinant viral proteins and development of immunological methods for differential diagnosis of Zika virus infection and other arboviruses. Specific objective (s): To produce recombinant viral proteins of interest by heterologous expression using synthetic DNA technology; evaluate monoclonal antibodies against selected Zika viral proteins; to evaluate the antigenicity and immunogenicity of the expressed proteins against reference samples of each of these viruses, development and standardization of methods for the differential diagnosis through the detection of antigens and antibodies using ELISA and LUMINEX techniques and to evaluate the sensitivity and specificity of the methods with standardized clinical samples from patients infected with arboviruses. Materials and Method: The in silico antigenicity and immunogenicity of the amino acid sequences of the recombinant proteins were analyzed. To standardize and evaluate the assays, sera from the serum library of the Laboratory of Immunological and Molecular Diagnosis of Infectious and Parasitic Diseases of the Paulo Góes Institute of Microbiology (UFRJ), which were previously tested by RT-PCR for ZIKV, DENV and CHIKV. Four ZIKV recombinant partial proteins (Envelope, NS3 and NS5) with histidine tail at their C terminus were expressed using synthetic DNA optimizing the gene sequence. After expression, these proteins were purified on nickel columns by affinity chromatography. The indirect ELISA method for detection of IgG was standardized using these recombinant proteins and synthetic peptides from the Envelope and NS1 proteins in the diagnosis of ZIKV, through the detection of antibodies in clinical samples. A multiplex method (LUMINEX) for ZIKV diagnosis using the recENV protein was also standardized. Results: In silico analysis showed that all recombinant proteins have antigenic sites. A higher expression of recNS5, NS31 and 2 protein in soluble extract and of recENV protein of ZIKV in the insoluble extract was observed and they presented molecular weight of approximately 28 kDa, 25 kDa, 25 kDa and 30 kDa, respectively. After sequencing by mass spectrometry, the correct sequences were confirmed, with the exception of recNS5 ZIKV, but with contamination by E. coli peptides and a second expression of recENV was performed. An ELISA test was standardized using the second expressed ZIKV recENV and a sensitivity of 67% and a specificity of 96% was observed. A study of IgM and IgG antibody kinetics was performed using sera from 8 patients in follow-up, which mostly showed an expected production of antibodies. Three peptides from ENV ZIKV and one from NS1 ZIKV, showed immunoreactivity when tested with positive samples for ZIKV, DENV and negative control. A multiplex Luminex test was performed using the recENV ZIKV protein and showed differentiation between positive and negative sera-
Descrição: dc.description169 f.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Idioma: dc.languagept_BR-
Direitos: dc.rightsOpen Access-
Direitos: dc.rightsCC-BY-SA-
Palavras-chave: dc.subjectDiagnóstico Imunológico-
Palavras-chave: dc.subjectArboviroses-
Palavras-chave: dc.subjectZika-
Palavras-chave: dc.subjectProteínas recombinantes-
Palavras-chave: dc.subjectZika vírus-
Palavras-chave: dc.subjectArbovírus-
Palavras-chave: dc.subjectArbovirose-
Palavras-chave: dc.subjectDiagnóstico-
Palavras-chave: dc.subjectProteínas recombinantes-
Palavras-chave: dc.subjectArbovirus-
Palavras-chave: dc.subjectZIKV-
Palavras-chave: dc.subjectImmunological diagnosis-
Palavras-chave: dc.subjectrecombinant proteins-
Título: dc.titleDiagnóstico diferencial da infecção pelo vírus zika e outras arboviroses: produção de proteínas recombinantes com potencial antigênico para o desenvolvimento de métodos imunológicos-
Tipo de arquivo: dc.typeTese-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense - RiUFF

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