CRISPR em enterococos: distribuição, correlação com virulência, resistência a antimicrobianos e edição gênica

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Autor(es): dc.contributorNeves, Felipe Piedade Gonçalves-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/5289973921789746-
Autor(es): dc.contributorRabello, Renata Fernandes-
Autor(es): dc.contributorRibeiro, Rachel Leite-
Autor(es): dc.contributorAbreu, Tatiana Castro Pinto de-
Autor(es): dc.contributorOliveira, Laura Maria Andrade de-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/1541197317711275-
Autor(es): dc.creatorSantos, Bárbara Araújo dos-
Data de aceite: dc.date.accessioned2024-07-11T18:13:37Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2024-07-11T18:13:37Z-
Data de envio: dc.date.issued2022-11-28-
Data de envio: dc.date.issued2022-11-28-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://app.uff.br/riuff/handle/1/27108-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/766195-
Descrição: dc.descriptionAs infecções enterocócicas são consideradas graves ameaças à saúde pública, sobretudo diante de seu potencial oportunista e de sua característica de multirresistência, notadamente das cepas de enterococos resistentes à vancomicina (VRE). Dez genótipos de resistência foram descritos para vancomicina, uma das drogas de última linha para o tratamento de infecções enterocócicas graves. Entre estes, destacam-se vanA e vanB como os mais clinicamente relevantes. Alguns estudos associam à perda ou ausência de sistemas CRISPR-Cas (clustered, regularly interspaced short palindromic repeats – CRISPR associated) – um mecanismo de defesa contra a entrada de DNA exógeno – a um maior potencial de resistência e virulência entre os enterococos. Além disso, sistemas CRISPR-Cas têm sido usados como ferramenta de edição gênica com potencial para tratamento de doenças genéticas e infecciosas. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação dos elementos CRISPR com o potencial de virulência e a resistência a antimicrobianos, além de desenhar uma ferramenta baseada no sistema CRISPR-Cas9 com o intuito reverter a resistência à vancomicina mediada pelos operons vanA e vanB. Foram analisadas 299 amostras de origem clínica obtidas entre agosto de 2012 e 2019 pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de Cocos Gram Positivos (MIP/CMB/UFF). Todas as amostras foram identificadas por MALDI-TOF e os perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos foram determinados por testes de disco-difusão. A investigação da presença de cinco genes de virulência, resistência a antimicrobianos e de três regiões CRISPR foi realizada por PCR. O desenho de gRNA para inativação dos operons vanA e vanB foi feito com auxílio do software da IDT. Do total, 146 (48,8%) amostras eram VRE (79 E. faecalis; 62 E. faecium; 3 E. gallinarum e 2 E. avium) e 153 (51,2%) eram enterococos sensíveis à vancomicina (VSE; 130 E. faecalis; 19 E. faecium; 2 E. gallinarum, 1 E. casseliflavus e 1 E. durans). Ao todo, 217 (72,6%) amostras eram multirresistentes (MDR). A não-susceptibilidade à eritromicina, fluoroquinolonas e penicilina foi identificada em 111 (37,1%) amostras, entre as quais 56 (50%) eram VRE da espécie E. faecium (VREfm) e 51 (46%) VRE da espécie E. faecalis (VREfs). Entre os genótipos de resistência, os mais frequentes foram erm(B) (n=108; 36,1%) para os macrolídeos, tet(M) (n=93; 31,1%) para tetraciclina, vanA (n=133; 44,5%) para os glicopeptídeos e aac(6’)-Ie+aph(2”)-Ia (n=62; 20.7%) para os aminoglicosídeos. Os genes de virulência gelE (n=149; 67,7%), asa1 (n=117; 53,2%) e esp (n=112; 50,9%) foram os mais comuns. Das 299 amostras, 168 (56,2%) apresentaram pelo menos uma região CRISPR investigada. CRISPR1-cas foi verificado em 75 (44,6%) amostras, CRISPR2 em 66 (39,3%) e CRISPR3-cas em 113 (67,3%). Elementos CRISPR foram mais comuns em E. faecalis do que em E. faecium (p<0.05). Associações significativas (p<0,05) com a ausência de elementos CRISPR foram observadas em amostras com fenótipo MDR e com a presença de genes de resistência [ant(6)-Ia, aph(3)-IIIa, erm(B) e vanA] e virulência (hyl e esp), porém associações positivas também foram verificadas entre a presença de elementos CRISPR com o fenótipo (tetraciclina) e genótipo de resistência tet(M) e virulência (gelE e asa1). Foram desenhados quatro diferentes gRNA com potencial para inativar o operon vanA e três gRNA para vanB. A eficiência dessa ferramenta em reverter a resistência à vancomicina constitui etapa futura. Nossos dados indicam maior presença de certos genes de resistência e virulência em amostras sem elementos CRISPR. Por outro lado, associações positivas com outros genes de resistência e virulência sugerem que a presença desses genes pode conferir uma vantagem adaptativa às cepas que os carreiam-
Descrição: dc.descriptionFundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro-
Descrição: dc.descriptionCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-
Descrição: dc.descriptionEnterococcal infections represent serious threats to public health due to their opportunistic potential and multidrug resistance (MDR) characteristics, especially vancomycin-resistant enterococci (VRE) strains. Ten resistance genotypes have been described for vancomycin, one of the last-line drugs for treating severe enterococcal infections. The vanA and vanB genes are the most clinically relevant genotypes. Some studies have associated the loss or absence of CRISPR-Cas (clustered, regularly interspaced short palindromic repeats – CRISPR associated) systems, a defense mechanism against the entry of exogenous DNA, to a higher potential for resistance and virulence among enterococci. Furthermore, CRISPR-Cas systems have been used for gene editing with potential for treatment of genetic disorders and infectious diseases. The aim of this study is to evaluate the association of CRISPR elements with virulence and antimicrobial resistance genes, as well as to design a CRISPR-based tool to reverse vancomycin resistance mediated by the vanA and vanB operons. We analyzed 299 clinical isolates obtained between August 2012 and 2019, which belong to the culture collection of the Laboratório de Cocos Gram Positivos (MIP/CMB/UFF). All isolates were identified by MALDI-TOF and phenotypic antimicrobial resistance profiles were determined by disk-diffusion tests. The detection of virulence and antimicrobial resistance genes, as well as CRISPR elements, was performed by PCR. After in silico analyses, we designed gRNAs to inactivate the vanA and vanB operons with a CRISPR-Cas9-based tool. Of total, 146 (48.8%) isolates were VRE (79 E. faecalis; 62 E. faecium; 3 E. gallinarum and 2 E. avium) and 153 (51.2%) were vancomycin-sensitive enterococci (VSE; 130 E. faecalis; 19 E. faecium; 2 E. gallinarum, 1 E. casseliflavus and 1 E. durans). In total, 217 (72.6%) isolates were MDR. Non-susceptibility to erythromycin, fluoroquinolones, and penicillin was identified in 111 (37.1%) isolates, among which 56 (50%) were vancomycin-resistant E. faecium (VREfm) and 51 (46%) were vancomycin-resistant E. faecalis (VREfs). Among the resistance genes, the most frequent were erm(B) (n=108; 36,1%) for macrolides, tet(M) (n=93; 31,1%) for tetracycline, vanA (n=133; 44.5%) for glycopeptides and aac(6')-Ie+aph(2")-Ia (n=62; 20.7%) for aminoglycosides. The gelE (n=149; 67.7%), asa1 (n=117; 53,2%), and esp (n=112; 50,9%) virulence genes were the most common. Of 299 isolates, 168 (56.2%) isolates had at least one CRISPR region. CRISPR1-cas was verified in 75 (44.6%) isolates, CRISPR2 in 66 (39.3%) isolates and CRISPR3-cas in 113 (67.3%) isolates. CRISPR elements were more common in E. faecalis than in E. faecium (p<0.05). Significant associations (p<0.05) with the absence of CRISPR elements were observed in isolates with MDR phenotype and with the presence of resistance [ant(6)-Ia, aph(3)IIIa, erm(B) and vanA] and virulence (hyl and esp). However, positive associations were also observed between the presence of CRISPR elements with phenotype (tetracyline) and genotype of resistance tet(M) and virulence (gelE and asa1). We designed 4 different gRNAs with the potential to inactivate the vanA operon and 3 gRNAs to inactivate the vanB operon. The efficiency of this tool in reversing vancomycin resistance will be evaluated in future steps. Our data indicate a greater presence of certain resistance and virulence genes in isolates without CRISPR elements. On the other hand, positive associations with other resistance and virulence genes suggest that the presence of these genes may confer an adaptive advantage to the strains that carry them-
Descrição: dc.description129 f.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Idioma: dc.languagept_BR-
Direitos: dc.rightsOpen Access-
Direitos: dc.rightsCC-BY-SA-
Palavras-chave: dc.subjectEnterococos-
Palavras-chave: dc.subjectCRISPR-
Palavras-chave: dc.subjectVRE-
Palavras-chave: dc.subjectResistência a antimicrobianos-
Palavras-chave: dc.subjectVirulência-
Palavras-chave: dc.subjectEnterococcus-
Palavras-chave: dc.subjectRepetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas-
Palavras-chave: dc.subjectEnterococos resistentes à vancomicina-
Palavras-chave: dc.subjectVirulência-
Palavras-chave: dc.subjectAnti-infecciosos-
Palavras-chave: dc.subjectEnterococci-
Palavras-chave: dc.subjectCRISPR-
Palavras-chave: dc.subjectVRE-
Palavras-chave: dc.subjectAntimicrobial resistance-
Palavras-chave: dc.subjectVirulence-
Título: dc.titleCRISPR em enterococos: distribuição, correlação com virulência, resistência a antimicrobianos e edição gênica-
Tipo de arquivo: dc.typeTese-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense - RiUFF

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