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Ensaios off-line e em fluxo para a triagem de inibidores da enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase humana por cromatografia líquida de alta eficiência
Use este link compartilhar ou citar este material: http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/765906
Registro completo de metadados
| Metadados | Descrição | Idioma |
|---|---|---|
| Autor(es): dc.contributor | Moraes, Marcela Cristina de | - |
| Autor(es): dc.contributor | Cass, Quezia Bezerra | - |
| Autor(es): dc.contributor | Rodrigues, Silvana Vianna | - |
| Autor(es): dc.creator | Ximenes, Isabela Abreu Trindade | - |
| Data de aceite: dc.date.accessioned | 2024-07-11T18:12:51Z | - |
| Data de disponibilização: dc.date.available | 2024-07-11T18:12:51Z | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2023-07-18 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2023-07-18 | - |
| Fonte completa do material: dc.identifier | http://app.uff.br/riuff/handle/1/29393 | - |
| Fonte: dc.identifier.uri | http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/765906 | - |
| Descrição: dc.description | A enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase humana (HsPNP) participa da via de recuperação de purinas e está presente em altos níveis nos tecidos linfoides. Ela tem sido considerada um dos alvos terapêuticos mais promissores para células T defeituosas. Portanto, o desenvolvimento de métodos de triagem rápidos e confiáveis para a identificação de inibidores da HsPNP é uma estratégia importante para elaboração de novos fármacos para alcançar a supressão de células T. Dentro deste contexto, neste trabalho é a descrita a imobilização da HsPNP na superfície das partículas magnéticas para monitorar sua atividade através da quantificação cromatográfica direta do produto formado utilizando ensaios off-line e em fluxo. Na abordagem off-line, as partículas magnéticas recobertas com a enzima HsPNP são incubadas com o substrato em microtubos e o produto formado é quantificado através de um método cromatográfico desenvolvido e validado. No sistema em fluxo, as partículas magnéticas contendo a enzima HsPNP imobilizada são aprisionadas dentro de um microtubo e inseridas no sistema cromatográfico o qual fornece a rápida separação cromatográfica do substrato e produto da reação catalisada pela enzima. Os métodos validados foram utilizados para o estudo da estabilidade e obtenção dos parâmetros cinéticos para a enzima imobilizada, assim como para a triagem, identificação e caracterização de inibidores. A enzima imobilizada nas partículas magnéticas reteve sua eficiência catalítica com elevada estabilidade por aproximadamente seis meses em ambos os modelos de ensaio. O derivado de imucilina de quarta geração (DI4G), previamente identificado como inibidor da HsPNP, foi reconhecido e caracterizado como inibidor competitivo através das diferentes abordagens, com valores de IC50 iguais a 13,9 ± 1,3 e 317 ± 26,7 nmol.L-1 nos ensaios off-line e em fluxo, respectivamente. As duas metodologias desenvolvidas apresentam diversas vantagens sobre os ensaios tradicionais em solução, como baixo custo, fácil recuperação da enzima do meio reacional, viabilizando a sua reutilização, e confiabilidade do método por envolver o monitoramento da atividade enzimática através da quantificação direta do produto formado. Além disso, o sistema de cromatografia líquida multidimensional possibilitou a realização de análises rápidas e automatizadas para a identificação e caracterização de novos inibidores. Ambos os métodos foram aplicados na triagem de ribonucleosídeos inéditos e os resultados demonstram a seletividade da HsPNP imobilizada, visto que tais compostos não modularam a atividade enzimática. Portanto, os métodos desenvolvidos podem ser empregados como uma ferramenta valiosa na busca de novos ligantes da enzima HsPNP. | - |
| Descrição: dc.description | The Human Purine Nucleoside Phosphorylase enzyme (HsPNP) participates in the purine recovery pathway and it is present at high levels in lymphoid tissues. It has been considered one of the most promising therapeutic targets for defective T-cells. Therefore, the development of fast and reliable screening methods for the identification of HsPNP inhibitors is an important strategy for the elaboration of new drugs to achieve T-cell suppression. Within this context, this work describes the HsPNP immobilization on the surface of magnetic particles to monitor its activity through direct chromatographic quantification of the formed product using off-line and on-flow assays. In the off-line approach, magnetic particles covered with the HsPNP enzyme are incubated with the substrate inside of microtubes and the formed product is quantified through a developed and validated chromatographic method. In the on-flow system, magnetic particles containing the immobilized HsPNP enzyme are confined inside of a microtube and inserted into the chromatographic system which provides a rapid chromatographic separation of the substrate and product of the reaction catalyzed by the enzyme. Validated methods were used to the stability study and to obtain kinetic parameters for the immobilized enzyme, as well as for the screening, identification and characterization of inhibitors. The immobilized enzyme in magnetic particles retained its catalytic efficiency with high stability for approximately six months in both test models. The fourth generation immucillin derivative (DI4G), previously identified as a HsPNP inhibitor, was recognized and characterized as a competitive inhibitor through different approaches, with IC50 values equal to 13.9 ± 1.3 and 317 ± 26.7 nmol . L-1 in the off-line and on-flow assays, respectively. Both methodologies developed presented several advantages over traditional in solution trials, such as low cost, easy enzyme recovery of the reactionary environment, enabling its reuse, and reliability of the method by involving the monitoring of enzyme activity through the direct quantification of the formed product. In addition, the multidimensional liquid chromatography system provided rapid and automated analyses for the identification and characterization of new inhibitors. Both methods were applied for the screening of unpublished ribonucleosides and the results demonstrated the selectivity of immobilized HsPNP, since these compounds did not modulate enzymatic activity. Therefore, methods developed can be used as valuable tools in the search for new ligands of the HsPNP enzyme. | - |
| Descrição: dc.description | 113 f. | - |
| Formato: dc.format | application/pdf | - |
| Idioma: dc.language | pt_BR | - |
| Direitos: dc.rights | Open Access | - |
| Direitos: dc.rights | CC-BY-SA | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Inibidor enzimático | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Purina Nucleosídeo Fosforilase Humana | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Imobilização | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Nucleosídeo de purina | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Cromatografia líquida de alta pressão | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Cinética química | - |
| Título: dc.title | Ensaios off-line e em fluxo para a triagem de inibidores da enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase humana por cromatografia líquida de alta eficiência | - |
| Título: dc.title | Offline and flow-through assays for screening inhibitors of the human Purine Nucleoside Phosphorylase enzyme by high-performance liquid chromatography | - |
| Tipo de arquivo: dc.type | Dissertação | - |
| Aparece nas coleções: | Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense - RiUFF | |
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