Imobilização da enzima Hipoxantina-Guanina Fosforribosil Transferase de Mycobacterium tuberculosis para o desenvolvimento de métodos de triagem

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Autor(es): dc.contributorMoraes, Marcela Cristina de Moraes-
Autor(es): dc.contributorSoares, André von Held-
Autor(es): dc.contributorBoechat, Fernanda da Costa Santos-
Autor(es): dc.contributorMoraes, Marcela Cristina de-
Autor(es): dc.contributorSoares, André von Held-
Autor(es): dc.contributorBoechat, Fernanda da Costa Santos-
Autor(es): dc.creatorSouza, Thaysa Martins de-
Data de aceite: dc.date.accessioned2024-07-11T18:09:21Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2024-07-11T18:09:21Z-
Data de envio: dc.date.issued2022-02-21-
Data de envio: dc.date.issued2022-02-21-
Data de envio: dc.date.issued2022-02-14-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://app.uff.br/riuff/handle/1/24596-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/764694-
Descrição: dc.descriptionA tuberculose humana (TB) tem como principal agente a Mycobacterium tuberculosis (Mt). Na busca por substâncias bioativas contra a tuberculose, tem-se como biomolécula alvo a enzima hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HGPRT), que catalisa a reação, dependente de Mg2+, entre osforibosilpirofosfato (PRPP) e hipoxantina, para formação de inosina-5-monofosfato (IMP) e pirofosfato inorgânico. Com isso, novos inibidores de enzimas chave de processos bioquímicos essenciais para o desenvolvimento da micobactéria têm sido rastreados. Dentre as estratégias mais modernas de ensaios de triagem de inibidores, o uso de enzimas imobilizadas é uma alternativa vantajosa devido à possibilidade de sua reutilização. Assim, este projeto visa o desenvolvimento de um método de triagem de alta eficiência baseado na cromatografia de bioafinidade para a rápida identificação de inibidores da enzima HGPRT, como potenciais fármacos para o tratamento da tuberculose. A enzima foi imobilizada covalentemente em partículas magnéticas de Fe3O4 com terminação amino através do uso do glutaraldeído como espaçador. O monitoramento da atividade da enzima imobilizada foi realizado através da quantificação direta do IMP formado na catálise enzimática. Para isso, foi desenvolvido um método cromatográfico para a separação de IMP, hipoxantina e PRPP em uma coluna analítica C18. A melhor separação obtida envolveu o uso de uma coluna C18, solução 1% TEA pH 6,0:MeOH (97:3) como fase móvel a uma vazão de 0,8 mL.min-1. O método desenvolvido foi validado para viabilizar a quantificação do IMP formado através da avaliação das seguintes figuras de mérito: linearidade (y= 6249,3x - 39857, R2= 0,998), exatidão (94% – 123%), precisão (4,91 – 5,94%), seletividade e reprodutibilidade. Para a otimização do ensaio enzimático foram avaliadas quantidades diferentes de partículas magnéticas contendo a enzima imobilizada e os tempos reacionais, sendo que a melhor condição estudada envolveu o uso de 0,5 mg de partículas magnéticas recobertas com a enzima imobilizada e 30 segundos de tempo reacional. O estudo cinético foi realizado para se obter o valor da constante KM para os substratos, de acordo com a equação de Michaelis-Menten. Para o PRPP foi encontrado o valor de 163,7 μmol.L-1 e para a hipoxantina de 24,9 μmol.L-1. Além disso, a enzima se mostrou estável durante um período de 56 dias e o rendimento da imobilização foi de 100%. Assim, pode-se concluir que a enzima foi imobilizada com sucesso na superfície das partículas magnéticas, com retenção de sua atividade catalítica e elevada estabilidade, sendo, portanto, uma estratégia promissora para a triagem de novos inibidores enzimáticos específicos.-
Descrição: dc.descriptionHuman tuberculosis (TB) has as its main agent Mycobacterium tuberculosis (Mt). In the search by bioactive substances against tuberculosis, the target biomolecule is the hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase enzyme (HGPRT), which catalyzes the reaction, dependent on Mg2+, between phosphoribosylpyrophosphate (PRPP) and hypoxanthine, for the formation of inosine-5-monophosphate (IMP) and inorganic pyrophosphate. Thereby, new inhibitors of key enzymes from biochemical processes essentials for the development of the mycobacteria have been tracked. Among the most modern strategies for inhibitor screening assays, the use of immobilized enzymes is an advantageous alternative due to the possibility of their reuse. Thus, this project aims to develop a high efficiency screening method based on bio affinity chromatography for the rapid identification of HGPRT enzyme inhibitors, as potential drugs for the treatment of tuberculosis. The enzyme was covalently immobilized in Fe3O4 magnetic particles with amino termination using glutaraldehyde as a spacer. The monitoring of the activity of the immobilized enzyme was performed through the direct quantification of the IMP formed by the enzymatic catalysis. For this, a chromatographic method was developed for the for the separation of IMP, hypoxanthine and PRPP in a C18 analytical column. The chromatographic method developed was validated to obtain the calibration curve to quantify the best separation obtained involved the use of a C18 column, 1% TEA solution pH 6.0: MeOH (97:3) as a mobile phase at a flow rate of 0.8 mL.min-1. The developed method was validated to enable the quantification of the formed IMP through the evaluation of the following figures of merit: linearity (y= 6249.3x - 39857, R2= 0.998)accuracy (94% – 123%), precision (4.91 – 5.94%), selectivity and reproducibility. For the optimizations of the enzymatic assay, different amounts of magnetic particles containing the immobilized enzyme and reaction times were evaluated, and the best condition studied involved the use of 0.5 mg of magnetic particles covered with the immobilized enzyme and 30 seconds of reaction time. The kinetic study was carried out to obtain the value of the KM constant for the substrates, according to the Michaelis-Menten equation. For PRPP, was found the value of 163.7 μmol.L-1 and for hypoxanthine, 24.9 μmol.L-1. In addition, the enzyme was stable over a period of 56 days and the immobilization yield were 100%. Thus, it can be concluding that the enzyme was successfully immobilized on the surface on the magnetic particles, with retention of its catalytic activity and high stability, being, therefore, a promising strategy of new specific enzyme inhibitors-
Descrição: dc.description72 f.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Idioma: dc.languagept_BR-
Publicador: dc.publisherNiterói-
Direitos: dc.rightsOpen Access-
Direitos: dc.rightsCC-BY-SA-
Palavras-chave: dc.subjectMycobacterium tuberculosis-
Palavras-chave: dc.subjectcromatografia líquida-
Palavras-chave: dc.subjectHGPRT-
Palavras-chave: dc.subjectimobilização enzimática-
Palavras-chave: dc.subjectMycobacterium tuberculosis-
Palavras-chave: dc.subjectCromatografia a líquido de alta eficiência-
Palavras-chave: dc.subjectEngenharia química-
Palavras-chave: dc.subjectMycobacterium tuberculosis-
Palavras-chave: dc.subjectliquid chromatography-
Palavras-chave: dc.subjectHGPRT-
Palavras-chave: dc.subjectenzymatic immobilization-
Título: dc.titleImobilização da enzima Hipoxantina-Guanina Fosforribosil Transferase de Mycobacterium tuberculosis para o desenvolvimento de métodos de triagem-
Tipo de arquivo: dc.typeTrabalho de conclusão de curso-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense - RiUFF

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