Suportes magnéticos na imobilização da enzima nucleosídeo hidrolase de Leishmania donovani para o desenvolvimento de ensaios de triagem

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MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorMoraes, Marcela Cristina de-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/4092328724086308-
Autor(es): dc.contributorRomeiro, Gilbert Alves-
Autor(es): dc.contributorAlves, Marina Amaral-
Autor(es): dc.contributorCassaro, Rafael Alves Allão-
Autor(es): dc.contributorCardoso, Carmen Lucia-
Autor(es): dc.contributorCass, Quezia Bezerra-
Autor(es): dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/8556659500839162-
Autor(es): dc.creatorOliveira, Pamella Christina Ortega de-
Data de aceite: dc.date.accessioned2024-07-11T17:50:37Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2024-07-11T17:50:37Z-
Data de envio: dc.date.issued2023-10-24-
Data de envio: dc.date.issued2023-10-24-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://app.uff.br/riuff/handle/1/30958-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/758631-
Descrição: dc.descriptionA enzima nucleosídeo hidrolase (NH) possui papel fundamental na sobrevivência dos protozoários do gênero Leishmania. A sua presença em mamíferos ainda não foi reportada, o que a torna um alvo interessante para o desenvolvimento de protótipos de novos fármacos mais seletivos. A leishmaniose visceral (LV) é considerada uma das formas clínicas mais severas desse grupo de doenças e é causada por protozoários da espécie Leishmania donovani. Portanto, o desenvolvimento de novos ensaios de triagem, com elevada eficiência e produtividade, para a identificação de inibidores da NH pode acelerar as primeiras etapas do processo de descoberta de fármacos para o tratamento da LV. Neste trabalho, a enzima NH de Leishmania donovani (LdNH) foi imobilizada covalentemente em partícula magnética (PM) comercial de 1 μm e em nanopartículas magnéticas (NPMs), de diferentes tamanhos de diâmetro (25, 57, 105 nm) e recobrimentos (recobrimento com camada de sílica e ligante orgânico - ácido 6-aminoexil fosfônico), sintetizadas a partir da termo decomposição do acetilacetonato de ferro (III). Inicialmente, utilizou-se PM para o desenvolvimento e qualificação do ensaio de triagem em fluxo. Utilizando um arranjo de 8 imãs, PM recobertas com enzima foram retidas em um tubo de politetrafluoretileno resultando em um reator com enzima imobilizada (LdNH-PM-IMER), que foi acoplado ao sistema de cromatografia líquida através de uma conexão “T” para o monitoramento da atividade enzimática através da quantificação do produto hipoxantina por CLAE-DAD. Estudos cinéticos forneceram um valor de KMapp de 2079 ± 87 μmol L-1 para o substrato inosina utilizando LdNH-PM-IMER. A qualificação do LdNH-PM-IMER para fins de triagem em fluxo foi realizada com uma série de 14 ribonucleosídeos sintéticos. Destes, quatro foram identificados como novos inibidores competitivos de LdNH, com valores de Ki entre 29,7 e 169,4 μmol L-1. As NPMs foram empregadas na imobilização da LdNH e utilizadas em dois métodos de ensaio de atividade distintos. Utilizando o ensaio de atividade estático, as LdNH-NPMs foram caracterizadas através de estudo cinético e pela avaliação de sua estabilidade e reusabilidade. Após estudo no modo estático, as LdNH-NPMs foram utilizadas no método em fluxo, que através de estudo cinético, foi possível otimizar as condições experimentais do ensaio. O estudo cinético dos LdNH-NPM-IMERs apresentou valores de KMapp na faixa de 1929 – 3962 μmol L-1, utilizando um terço da massa de suporte usada na fabricação de LdNH-PM-IMER. O novo ensaio de triagem em fluxo desenvolvido provou ser confiável e uma valiosa ferramenta para a identificação de novas substâncias bioativas. O uso das NPMs no desenvolvimento desses métodos permitiu uma miniaturização do sistema, otimizando o uso de alvo biológico sem perder a eficiência.-
Descrição: dc.descriptionThe nucleoside hydrolase (NH) enzyme is crucial for the survival of protozoa of the genus Leishmania. Its presence in mammals has not yet been reported, making it an interesting target for the development of prototypes of new and more selective drugs. Visceral leishmaniasis (VL) is considered one of the most severe clinical forms of this group of diseases and is caused by protozoa of the species Leishmania donovani. Therefore, the development of new screening assays, with high efficiency and productivity, for the identification of NH inhibitors can accelerate the first steps of the drug discovery process for the treatment of VL. In this work, the NH of Leishmania donovani (LdNH) was covalently immobilized on 1 µm commercial magnetic particle (PM) and on magnetic nanoparticles (NPMs) of different sizes (25, 57, 105 nm) and coatings (coating with silica layer and organic ligand, 6-aminoexyl phosphonic acid) obtained through the thermal decomposition of Iron(III) acetylacetonate. Initially, PM was used for the development and qualification of an on-flow screening assay. Through an arrangement of 8 magnets, PMs coated with LdNH were retained in a politetrafluoretilene tubing producing an immobilized enzyme reactor (LdNH-PMIMER) that was inserted into the liquid chromatography system through a "T" connection. Enzyme activity was monitored by HPLC-DAD measuring the amount of hypoxanthine, the product of NH-catalyzed hydrolysis of inosine. The kinetic study provided a KMapp value of 2079 ± 87 µmol L-1 for the inosine substrate using PM. Qualification of the on-flow screening methodology using LdNH-MP-IMER allowed the identification of four new competitive inhibitors (Ki values between 29.7 and 169.4 µmol L-1 ) among 14 synthetic ribonucleosides. NPMs were evaluated for LdNH immobilization and used in two distinct activity methodologies. Using the static activity assay, the LdNH-NPMs were characterized through kinetic studies, stability, and reusability. LdNH-NPMs were then employed in the on-flow methodology, which through kinetic studies, the experimental conditions were optimized. The kinetic study of LdNH-NPM-IMERs showed KMapp values ranging from 1929 - 3962 µmol L-1 , using one-third of the support mass compared to LdNH-MP-IMER. The new reliable on-flow screening assay demonstrated its effectiveness in identifying new bioactive compounds. The use of NPMs in the development of these methodologies allowed miniaturization of the system, optimizing the use of biological target without losing efficiency-
Descrição: dc.description168 f.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Idioma: dc.languagept_BR-
Direitos: dc.rightsOpen Access-
Direitos: dc.rightsCC-BY-SA-
Palavras-chave: dc.subjectNucleosideo hidrolase-
Palavras-chave: dc.subjectLeishmaniose visceral-
Palavras-chave: dc.subjectPartículas magnéticas-
Palavras-chave: dc.subjectEnsaios de triagem-
Palavras-chave: dc.subjectImobilização enzimática-
Palavras-chave: dc.subjectProtozoário-
Palavras-chave: dc.subjectNucleosideo-
Palavras-chave: dc.subjectLeishmaniose-
Palavras-chave: dc.subjectNanopartícula-
Palavras-chave: dc.subjectCromatografia-
Palavras-chave: dc.subjectInibidor enzimático-
Palavras-chave: dc.subjectCinética enzimática-
Palavras-chave: dc.subjectNucleoside hydrolase-
Palavras-chave: dc.subjectVisceral leishmaniasis-
Palavras-chave: dc.subjectMagnetic particles-
Palavras-chave: dc.subjectScreening assays-
Palavras-chave: dc.subjectEnzyme immobilization-
Título: dc.titleSuportes magnéticos na imobilização da enzima nucleosídeo hidrolase de Leishmania donovani para o desenvolvimento de ensaios de triagem-
Título: dc.titleMagnetic supports in the immobilization of the Leishmania donovani nucleoside hydrolase enzyme for the development of screening assays-
Tipo de arquivo: dc.typeTese-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense - RiUFF

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