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Investigação das etapas limitantes durante a síntese de Ácido Hialurônico em Kluyveromyces lactis

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MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorParachin, Nádia Skorupa-
Autor(es): dc.creatorGomes, Antonio Milton Vieira-
Data de aceite: dc.date.accessioned2022-02-10T21:10:09Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2022-02-10T21:10:09Z-
Data de envio: dc.date.issued2021-12-21-
Data de envio: dc.date.issued2021-12-21-
Data de envio: dc.date.issued2021-12-21-
Data de envio: dc.date.issued2021-06-23-
Fonte completa do material: dc.identifierhttps://repositorio.unb.br/handle/10482/42613-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/647048-
Descrição: dc.descriptionTese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2021.-
Descrição: dc.descriptionO ácido hialurônico (AH) é um biopolímero composto de repetições alternadas dos monossacarídeos Ácido Glucurônico e N-Acetil glucosamina, sendo presente em todos os vertebrados. O AH possui uma vasta gama de aplicações, porém, suas qualidades como agente rejuvenescedor da derme o tornam um produto muito utilizado na indústria farmacêutica e médica. Atualmente o AH é produzido naturalmente por bactérias que são patogênicas aos animais, o que dificulta o escalonamento esta tecnologia de produção e eleva os custos de purificação. Como uma alternativa a estas bactérias, leveduras e outras bactérias foram geneticamente modificadas para síntese de AH produzindo valores de 0.1 até 74 g/L. Uma cepa da levedura luyveromyces lactis, denominada cepa BAP, foi construída visando produzir AH através da inserção dos genes hasA (codificante da enzima Hialuronan Sintase) e hasB (codificante da enzima UDP-Glicose Desidrogenase). Porém, após cultivo em biorreator foi alcançada uma produção final de 1,89 g/L, um valor ainda considerado baixo quando comparado à outras cepas de bactérias geneticamente modificadas que alcançam valores de até 74 g/L de AH. De forma a otimizar a síntese de AH na cepa BAP e torná-la mais competitiva com outras cepas para a indústria, foram realizadas uma série de estudos na cepa BAP de forma a identificar possíveis etapas limitantes para a síntese de AH. Inicialmente, foram medidos por RT-qPCR e RNA-Seq os níveis de 20 transcritos na cepa BAP, todos envolvidos com enzimas consideradas potenciais competidoras da síntese de AH. A partir destes dados foi sugerido que a síntese de trealose seria o maior competidor da síntese de AH na célula. Uma nova cepa derivada da cepa AP contendo uma disrupção do gene tps1 e incapaz de sintetizar trealose foi gerada, porém, não houve melhora na síntese de AH. A partir dos resultados obtidos dos níveis de transcritos do gene hasA na cepa BAP também foi criada uma segunda estratégia para desacoplamento da síntese de AH com a síntese de biomassa em K. lactis através da utilização de um circuito genético guiado por uma enzima Serina Integrase 13. Porém, esta estratégia também não apresentou efeitos no melhoramento da síntese de AH devido a uma ativação inesperada da transcrição do gene da Integrase ocasionada pelo promotor LAC4. Por fim, foi realizada uma Análise de Fluxo Metabólico (AFM) na cepa BAP onde foi observado que a principal limitação da síntese de AH está em um fluxo insuficiente próximo de 0 da via do precursor UDP-GlcNAc, sendo necessárias estratégias envolvendo um aumento do fluxo desta via. Embora a síntese de AH pela cepa BAP não tenha sido melhorada, este estudo foi um dos primeiros a realizar uma AFM em células de K. lactis e o primeiro a realizar uma AFM em uma cepa produtora de AH visando avaliar como a síntese do AH é afetada pelas vias síntese dos seus 2 precursores.-
Descrição: dc.descriptionConselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq).-
Descrição: dc.descriptionHyaluronic acid (HA) is a biopolymer composed of alternating repetitions of the monosaccharides Glucuronic Acid and N-Acetyl glucosamine, present in all vertebrates. HA has a wide range of applications, however, its uses as a dermis rejuvenating agent make it a product widely used in the pharmaceutical and medical industry. Currently, HA is naturally produced by bacteria that are pathogenic to animals, which makes it difficult to scale up this production technology and raises purification costs. As an alternative to these bacteria, yeasts and other bacteria were genetically modified for HA synthesis, producing values from 0.1 to 74 g/L. A strain of the yeast Kluyveromyces lactis, called the BAP strain, was constructed with the aim of producing HA through the insertion of the genes hasA (codifying the Hyaluronan Synthase enzyme) and hasB (codifying the UDP-Glucose Dehydrogenase enzyme). However, after cultivation in a bioreactor, a final production of 1.89 g/L was reached, a value still considered low when compared to other strains of genetically modified bacteria that reach values of up to 74 g/L of HA. In order to optimize the synthesis of HA in the BAP strain and make it more competitive with other strains for the industry, a series of studies were carried out in the BAP strain in order to identify possible limiting steps for the synthesis of HA. Initially, the levels of 20 transcripts in the BAP strain were measured by RT-qPCR and RNA-Seq, all involved with enzymes considered potential competitors of HA synthesis. From these data it was suggested that trehalose synthesis would be the major competitor of HA synthesis in the cell. A new strain derived from the BAP strain containing a disruption of the tps1 gene and incapable of synthesizing trehalose was generated, however, there was no improvement in HA synthesis. Based on the results obtained from the transcript levels of the hasA gene in the BAP strain, a second strategy was also created for uncoupling the HA synthesis with the biomass synthesis in K. lactis through the use of a genetic circuit guided by an enzyme Serine Integrase 13. However, this strategy also did not show effects in improving HA synthesis due to an unexpected activation of the Integrase gene transcription caused by the LAC4 promoter. Finally, a Metabolic Flux Analysis (MFA) was performed in the BAP strain where it was observed that the main limitation of HA synthesis is in an insufficient flux close to 0 of the precursor UDP-GlcNAc pathway, requiring strategies involving an increase in flow of this pathway. Although HA synthesis by the BAP strain has not been improved, this study was one of the first to perform a MFA in K. lactis cells and the first to perform a MFA in an HA-producing strain to assess how HA synthesis is affected by the synthesis pathways of its 2 precursors.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Direitos: dc.rightsAcesso Aberto-
Direitos: dc.rightsA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.-
Palavras-chave: dc.subjectÁcido hialurônico-
Palavras-chave: dc.subjectAnálise de fluxo metabólico-
Palavras-chave: dc.subjectBioprocesso-
Palavras-chave: dc.subjectLevedura-
Título: dc.titleInvestigação das etapas limitantes durante a síntese de Ácido Hialurônico em Kluyveromyces lactis-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional – UNB

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