Structural and functional characterization of novel lipolytic enzymes from a brazilian Cerrado soil metagenomic library

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Autor(es): dc.contributorKruger, Ricardo Henrique-
Autor(es): dc.creatorIstvan, Paula-
Data de aceite: dc.date.accessioned2021-10-14T18:21:13Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2021-10-14T18:21:13Z-
Data de envio: dc.date.issued2019-02-18-
Data de envio: dc.date.issued2019-02-18-
Data de envio: dc.date.issued2019-02-18-
Data de envio: dc.date.issued2018-06-15-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://repositorio.unb.br/handle/10482/34057-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/629580-
Descrição: dc.descriptionTese (doutorado)—Universidade de Brasília, Universidade Federal de Goiás, Universidade Federal do Mato Grosso, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Universidade Federal da Grande Dourados— Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2018.-
Descrição: dc.descriptionO solo do Cerrado tem sido foco de poucos estudos, especificamente sua diversidade microbiana. O solo é um habitat com alta diversidade de microrganismos e, portanto, pode ser fonte para a prospecção de enzimas industriais. A identificação de novos genes pela abordagem metagenômica levou à descoberta de novas atividades enzimáticas. As enzimas lipoliticas são produzidas principalmente por microorganismos, frequentemente bactérias, e desempenham um papel vital em iniciativas comerciais. A fim de isolar genes putativos de lipase, foi realizado um screening com tributirina em uma biblioteca metagenômica de solo de Cerrado. De 6.720 clones avaliados contendo um inserto de mediana de 8 Kb, foram isolados três com atividade lipolítica e dezoito seqüências codificantes foram preditas. LipX e lipY se agruparam a enzimas da família IV lipolítica, relacionados com lipase de Pseudomonas sp. (AAC38151), Cupriavidus necator (AAC 41424) e Moraxella sp. (CAA37862). LipW apresentou semelhanças estruturais com uma enzima lipolítica de Pseudomonas fluorescens e 28% de identidade de sequência, no mesmo ramo de quatro lipases / esterases da bactéria Moraxellaceae. Além disso, a tríade catalítica Ser-Asp-His foi localizada no motivo G-X-S-M-G-G, similar a outras lipases da família V. A purificação da lipX revelou uma proteína recombinante de 35 kDa, e da lipY revelou uma proteína recombinante de 32 kDa como previsto pelos dados de sequenciamento. O peso molecular estimado do LipW foi de 29 kDa, os parâmetros moleculares puderam ser associados ao monômero do lipW em correspondência com o seu MW teórico, como também se observou no gel de SDS-PAGE. A atividade enzimática foi observada de pH 3,0 a 10,0, com atividade ótima em pH 7,5,0-9,5 para lipX, pH 8,0-9,5 para lipY e em pH 9,0-9,5 para lipW. Dentro da faixa de temperatura de 25°C-95°C, a atividade máxima foi observada a 55°C para lipX, 60°C para lipY e 40°C para lipW. Os resultados da comparação entre o lipX com o algoritmo BLAST e o banco de dados de proteínas (PDB) exibiu 41% de identidade com mutante G84S EST2 de Alicyclobacillus acidocaldarius [PDB 2HM7] e dobra α/βhydrolase da família sensível ao hormônio IV Esterase/Lipase. Com os resíduos catalíticos: Ser156, Asp259 e His289 localizados entre o domínio α/β e o domínio helicoidal. O Ser156 está localizado no motivo de consenso GDSAGG, e também foi visto no alinhamento de sequência de lipX com outros membros da família IV. LipY tem uma tríade catalítica formada por Ser143, Glu237 e His267. LipY também contém um domínio CAP (Met1–Val45) além do domínio catalítico (Gln46–Arg306). O Ser143 catalítico está localizado no motivo GXSAG semi-conservado onde, em vez de Asp (GDSAG), o mais comum, há outro resíduo de carga negativa, Glu (GESAG). LipX e lipY contêm motivo HGG conservado, que está envolvido na formação do canal oxianionico. Juntos, os espectros de CD UV distante e a estrutura do modelo 3D baseada na modelagem por homologia indicam que a estrutura secundária lipX, Y e W consistia em α-hélice (~45%) e estruturas de folha-β (~15%), o que é consistente com a estrutura secundária predominantemente α-hélice da família α/β-hidrolase de esterases. A combinação de propriedades estruturais e funcionais demonstra que a abordagem metagenômica de ambientes nativos é adequada para descobrir novas enzimas lipolíticas com aplicação biotecnológica.-
Descrição: dc.descriptionThe Brazilian Cerrado soil has been focus of very few studies about its microbial diversity. Soil is a habitat with high diversity of microorganisms, thus can be a source for the prospection of industrial enzymes. The identification of new genes through the metagenomic approach has led to the discovery of novel enzyme activities. Lipases are mainly produced by microbes, most frequently bacterial, and play a vital role in commercial ventures. In order to isolate putative lipase genes, Cerrado soil metagenomic library was screened with tributyrin. From 6,720 clones evaluated with 8 Kb DNA size, three with lipolytic activity were isolated, and eighteen coding sequences were predicted. LipX and lipY clustered with lipolytic enzymes from family IV, closely related to a lipase from Pseudomonas sp. (accession number AAC38151), Cupriavidus necator (accession number AAC 41424) and Moraxella sp. (accession number CAA37862). LipW showed structural similarities with a Pseudomonas fluorescens lipolytic enzyme, and 28% sequence identity in the same branch as four lipases/esterases from Moraxellaceae bacteria. In addition, the Ser-Asp-His catalytic triad was localized in the G-X-S-M-G-G motif, similar to other family V lipases. The purification of lipX revealed a 35-kDa recombinant protein and lipY revealed a 32-kDa recombinant protein as predicted by the sequence data. Estimated molecular weight of LipW was 29 kDa, molecular parameters could be associated to the lipW monomer in correspondence with their theoretical MW, as also observed in the SDS-PAGE gel. Enzyme activity was observed from pH 3.0–10.0, with optimal activity at pH 7.5.0–9.5 for lipX, pH 8.0–9.5 for lipY and at pH 9.0–9.5 for lipW. Within the temperature range of 25°C–95°C, maximum activity was observed at 55°C for lipX, 60°C for lipY and 40°C for lipW. The results from the comparison of the lipX with BLAST algorithm against protein data bank (PDB) exhibited 41% identity with G84S EST2 mutant from Alicyclobacillus acidocaldarius [PDB 2HM7] and α/βhydrolase fold from the IV Esterase/Lipase hormone sensitive Family. With the catalytic residues: Ser156, Asp259 and His289 located between α/β domain and the helical domain. The Ser 156 is located in the consensus motif GDSAGG, as also showed in the sequence alignment of lipX with other members of related Family IV. LipY has a catalytic triad formed by Ser143, Glu237, and His267. LipY also contains a CAP domain (Met1–Val45) besides catalytic domain (Gln46–Arg306). The catalytic Ser143 is located in the semi-conserved GXSAG motif where instead of Asp (GDSAG), the most common; there is another negative-charged residue, Glu (GESAG). LipX and lipY contain a conserved HGG motif, which is involved in the formation of the oxyanion hole. Together, the far-UV CD spectra and 3D model structure based on homology modeling indicate that lipX,Y and W secondary structure consisted of α-helix (~45%) and β-sheet (~15%) structures, which is consistent with the predominantly α-helix secondary structure of the α/β-hydrolase family of esterases. The combination of structural and functional proprieties demonstrates that metagenomic approach of native environments is suitable for discovering novel lipolytic enzyme with biotechnological application.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Direitos: dc.rightsAcesso Aberto-
Palavras-chave: dc.subjectSolos - análise-
Palavras-chave: dc.subjectEnzimas lipoliticas-
Palavras-chave: dc.subjectMetagenoma-
Palavras-chave: dc.subjectMicroorganismos-
Título: dc.titleStructural and functional characterization of novel lipolytic enzymes from a brazilian Cerrado soil metagenomic library-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
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