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Metadados | Descrição | Idioma |
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Autor(es): dc.contributor | Borges, William de Castro | - |
Autor(es): dc.creator | Soares, Micheline | - |
Data de aceite: dc.date.accessioned | 2019-11-06T13:29:53Z | - |
Data de disponibilização: dc.date.available | 2019-11-06T13:29:53Z | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2014-02-07 | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2014-02-07 | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2012 | - |
Fonte completa do material: dc.identifier | http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/3455 | - |
Fonte: dc.identifier.uri | http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/556566 | - |
Descrição: dc.description | As leishmanioses constituem um grupo heterogêneo de doenças que abrangem áreas tropicais e subtropicais, sendo endêmicas em 88 países com aproximadamente 12 milhões de infectados e 350 milhões de pessoas expostas ao risco. Por ano, cerca de 1.500.000 casos de leishmaniose tegumentar e 500.000 casos de leishmaniose visceral (LV) são relatados. Os cães, os principais reservatórios domésticos, são considerados o principal elo na cadeia de transmissão da LV. A partir da disponibilidade dos dados de sequenciamento dos genomas de algumas espécies de Leishmania (L. major, L. infantum e L. braziliensis), ferramentas na área da proteômica podem ser empregadas para a identificação de novas proteínas com potencial para o diagnóstico, prognóstico e/ou o desenvolvimento de vacinas contra a leishmaniose. O foco do presente estudo constituiu a caracterização molecular do secretoma da espécie L. infantum, utilizando-se de uma abordagem proteômica. Promastigotas em fase log de crescimento foram submetidos ao cultivo sob duas condições experimentais. A primeira, nas condições normais de cultivo de promastigotas (pH 7.2 e temperatura de 26ºC) e, para a segunda, utilizando condições para mimetizar o microambiente de um fagolisossomo (pH 5.5 e temperatura de 35ºC). A homogeneidade do secretoma foi avaliada a partir da contagem de parasitos viáveis, durante diferentes tempos de cultivo, empregando marcação por iodeto de propídeo e citometria de fluxo. A técnica de marcação revelou que durante 8h de cultivo a percentagem de parasitos viáveis manteve-se aproximadamente 94%. A fração do sobrenadante de cultura, obtido durante 6h em pH 7.2, foi submetida à digestão em solução utilizando tripsina. Os peptídeos resultantes foram separados usando cromatografia de fase reversa e detectados para fragmentação a partir de uma interface acoplada ao espectrômetro de massas operando via electrospray. Após busca de homologia em bancos de dados foram identificadas 135 proteínas, as quais foram classificadas em 9 categorias funcionais e 1 hipotética. Dados sobre abundância relativa permitiram concluir que o secretoma de L. infantum está representado por basicamente três categorias (1) metabolismo de nucleotídeos, (2) metabolismo de carboidratos e (3) outros processos. Sessente e três proteínas foram submetidas à análises de bioinformática para predição de sinais moleculares indicativos de secreção, por meio de vias clássicas e não clássicas. Cerca de 50% das proteínas investigadas são potencialmente secretadas, das quais, 30% atingem o meio extracelular por vias não clássicas. Soros de animais naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas da LVC, foram utilizados para testar a imunogenicidade associada aos secretomas de L. infantum e L. amazonensis. Experimentos de Western blotting mostraram que ambas as preparações são úteis na identificação de animais portadores de LVC. Além disso, as mesmas frações podem ser utilizadas na discriminação de animais sintomáticos, daqueles portadores de outras formas clínicas da doença. Coletivamente, a caracterização molecular do secretoma de L. infantum e os ensaios preliminares de imunoproteômica abriram novas possibilidades de investigação relacionadas ao tratamento, prognóstico e diagnóstico da LVC. ________________________________________________________________________________ | - |
Descrição: dc.description | ABSTRACT: Leishmaniasis constitutes a heterogenous group of illnesses reaching tropical and subtropical areas worldwide. They are endemic in 88 countries where approximately 12 million people are affected and additional 350 million are exposed to the risk of infection. Annually, around 1.500.000 cases of tegumentary leishmaniasis and 500.000 cases of the visceral type (LV) are reported. Dogs, the principal domestic reservoirs, are considered the most important elements for the transmission of LV. The availability of genomic data for some Leishmania species (L. major, L. infantum and L. braziliensis) allowed the use of proteomic tools for the identification of novel proteins as targets for the diagnosis, prognosis and/or development of new vaccine preparations against leishmaniasis. The focus of the present investigation constituted the molecular characterization of the L. infantum secretome, using proteomic approaches. Promastigotes, under logarithmic phase of growth, were submitted to two different culture conditions. In the first, a regular promastigote culture was employed (pH 7.2 and temperature 26ºC) and for the second, it was intended to simulate the parasite’s habitat inside the phagolysosome´s microenvironment (pH 5.5 and temperature 35ºC). The homogeneity of the secretome was evaluated through the counting of viable parasites, cultivated for different periods, using propidium iodide and flow cytometry. The labeling technique revealed that during 8h in culture, the percentage of undamaged parasites was maintained around 94%. The culture supernatant, obtained during 6h in pH 7.2, was conditioned to in solution digestion using trypsin. The resulting peptides were detected and fragmented using reversed-phase chromatography, interfaced with a mass spectrometer operating via electrospray. After database searching, 135 proteins were identified and subsequently classified into 9 functional categories plus 1 hypothetical. The relative abundance index for each of the components allowed conclusion that the L. infantum secretome is mainly represented by three categories (1) nucleotide metabolism, (2) carbohydrate metabolism and (3) other processes. Sixty three proteins were submitted to bioinformatic analyses for the prediction of molecular signals indicative of secretion through classic and non-classic pathways. Approximately 50% of the investigated molecules are potentially secreted, of which, 30% reach the extracellular milieu using non-classic pathways. Sera of naturally infected animals, carriers of differing clinical forms of LVC, were used to test the immunogenicity associated to the secretomes of L. infantum and L. amazonensis. Western blotting experiments revealed that both preparations could be used for the identification of animal carriers of LVC. Moreover, the same preparations were useful to discriminate symptomatic animals among those exhibiting other clinical forms of the disease. Collectively, the molecular characterization of the L. infantum secretome and the preliminary immunoproteomic assays opened up new research avenues related to the treatment, prognosis and diagnosis of LVC. | - |
Idioma: dc.language | pt_BR | - |
Publicador: dc.publisher | Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. | - |
Palavras-chave: dc.subject | Secretoma | - |
Palavras-chave: dc.subject | Leishmania infantum | - |
Palavras-chave: dc.subject | Leishmaniose visceral | - |
Palavras-chave: dc.subject | Biomarcadores | - |
Título: dc.title | Análise proteômica do secretoma de Leishmania infantum e ensaios preliminares para a descoberta de biomarcadores da Leishmaniose visceral canina. | - |
Tipo de arquivo: dc.type | livro digital | - |
Aparece nas coleções: | Repositório Institucional - UFOP |
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