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Purificação preparativa de inibidores Bowman-Birk, quantificação em alimentos e características imunogênicas dos inibidores da Glycine max e da Macrotyloma axillare

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MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorAndrade, Milton Hércules Guerra de-
Autor(es): dc.creatorLeal, Sonaly Cristine-
Data de aceite: dc.date.accessioned2019-11-06T13:27:49Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2019-11-06T13:27:49Z-
Data de envio: dc.date.issued2013-04-12-
Data de envio: dc.date.issued2013-04-12-
Data de envio: dc.date.issued2010-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://hdl.handle.net/123456789/2744-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/555870-
Descrição: dc.descriptionOs inibidores do tipo Bowman-Birk, comumente chamados de BBI, são moléculas protéicas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir serino-proteases. Embora os mecanismos de atividade biológica dessas moléculas não estejam totalmente elucidados, o interesse por essa classe de inibidores está relacionado com a descoberta de que o BBI pode atuar como agente preventivo do câncer. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido estudada extensivamente, tanto em sua forma purificada quanto na forma de extrato protéico de soja enriquecido de BBI, chamado de BBI concentrado (BBIC). O emprego desses extratos enriquecidos em experimentos com animais e humanos deve-se ao elevado custo para a obtenção do BBI puro. Vários estudos demonstraram que esses extratos possuem atividade anti-carcinogênica similar ao BBI purificado. Entretanto, essa atividade, atribuída apenas ao BBI, poderia estar relacionada à presença de outros compostos quimiopreventivos nas preparações de BBIC, tais como a lunasina, isoflavonas e outros inibidores de tripsina. Desta forma, o primeiro objetivo deste trabalho baseou-se no desenvolvimento de métodos alternativos capazes de fornecer um enriquecido de BBI de soja de melhor qualidade, utilizando apenas processos típicos da indústria alimentícia. Os métodos propostos geraram preparações com elevado grau de pureza, comparado à homogeneidade das preparações de BBIC descritas anteriormente. A principal alteração do método tradicional de obtenção do BBIC consistiu na adição de EDTA ou citrato durante o tratamento térmico dos extratos protéicos. A análise das preparações por SDS-PAGE demonstrou que o BBI recuperado apresentou elevado grau de pureza. O uso de agentes quelantes provavelmente promoveu uma desestabilização das proteínas contaminantes, permitindo a remoção das mesmas por precipitação. Os inibidores Bowman-Birk, resultantes do emprego das metodologias propostas, foram identificados e caracterizados através de ensaios de atividade inibitória anti-tripsina e anti-quimotripsina, cromatografia de fase reversa e espectrometria de massa. Em paralelo, demonstramos que os anticorpos anti-BBI de Macrotyloma axillare foram úteis na identificação de BBIS por Western blot em nossas preparações. Essa reatividade cruzada pode ser atribuída à alta homologia estrutural compartilhada por esses inibidores encontrados nessas leguminosas. Por outro lado, experimentos realizados com anticorpos produzidos contra BBI de soja Glycine max (BBIS) e peptídeo sintético, correspondente à cabeça de inibição da quimotripsina do BBI, sugeriram que ambos inibidores são menos imunogênicos que o BBI de Macrotyloma axillare (BBIM). O terceiro objetivo consistiu na validação de um método de quantificação de BBI ativo presente em alimentos, através de ensaios de inibição enzimática. A metodologia desenvolvida foi de simples execução e demonstrou elevada sensibilidade, sendo comparável às técnicas imunoenzimáticas, tipicamente utilizadas para determinar a concentração de BBI em alimentos. A próxima estratégia envolveu a suplementação de dieta com 0,1% p/p de BBI e a avaliação do consumo de ração, durante um mês de tratamento. Os resultados mostraram que não houve diferença significativa no consumo da dieta e no peso dos animais entre os grupos controle e testes, sugerindo que a suplementação de alimentos com BBI pode constituir uma alternativa para estimular o consumo humano desse inibidor. Experimentos futuros poderão elucidar se as preparações de BBI utilizadas como suplementos em alimentos comprometem a palatabilidade dos mesmos. Entretanto, deve ser levada em consideração a observação de que camundongos alimentados oralmente com esse inibidor, produzem anticorpos anti-BBI os quais poderiam limitar a atividade do BBI como agente anti-carcinogênico. __________________________________________________________________________________________-
Descrição: dc.descriptionABSTRACT: Bowman-Birk Inhibitors (BBI) are protein molecules exhibiting two distinct inhibitory domains for serine-proteases. Although the mechanism of action is not entirely understood, these inhibitors have been shown to possess cancer preventive properties. The anti-cancer effects are associated with the use of either the purified BBI or enriched preparations of the inhibitors, commonly called BBIC. Indeed, the use of BBIC from soybeans, in human or animal experimentation, is justified by the cost associated with the production of highly purified BBI. Although BBIC contains a variety of compounds such as lunasin, other trypsin inhibitors and isoflavones, the chymopreventive properties of BBIC are attributed only to the presence of BBI. The first aim of this study was the development of alternative protocols for the production of BBIC of improved quality, using methods typically employed in the processing of a variety of foods. The methods utilized revealed a BBI with a high degree of purity, as indicated by the homogeneity of the product. The major alteration of the classic isolation protocol consisted of the addition of EDTA or citrate during heat treatment of the protein extract. As judged by SDS-PAGE analyses, the recovered BBI was of demonstrably higher purity. It was hypothesized that the use of chelating agents promoted destabilization of contaminant proteins, which lead to their removal by precipitation. The purified BBI was further characterized and identified by trypsin/chymotrypsin inhibition assays, reversed-phase chromatography and mass spectrometry. In parallel, the antibodies produced against M. axillare BBI displayed cross-reactivity against BBI purified from soy, a fact that demonstrates their usefulness for the identification of BBI present in the preparations by Western blot. This observation might be attributed to the highly conserved structure of BBI from these plants. In contrast, both Glycine max BBI (BBIS) and a synthetic peptide corresponding to the chymotrypsin inhibition head of BBI demonstrated a comparatively lower immunogenicity than Macrotyloma axillare BBI (BBIM). The third goal was the validation of a method for the quantification of active BBI present in foods through the use of inhibition assays. The employed method was straightforward and demonstrated increased sensitivity, which was comparable to that of immunoassays typically used to determine BBI levels in foods. The next strategy involved supplementation of a diet with 0.1 % purified BBI and the evaluation of animal consumption during one month’s treatment. The results revealed no significant difference for the consumption of the diet and animal body weight among the test and control groups. These findings suggest that diet supplementation with BBI might constitute an alternative to stimulate increased human intake of this inhibitor. Future experiments will also elucidate whether the BBI preparation could be used as a supplement without compromising food palatability. However, one should bear in mind the observation that, at least in mice, antibodies are produced against BBI given orally, and this fact could limit their activity as anticarcinogenic agents.-
Idioma: dc.languagept_BR-
Publicador: dc.publisherPrograma de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.-
Palavras-chave: dc.subjectSoja-
Palavras-chave: dc.subjectCâncer-
Palavras-chave: dc.subjectProteinase - Inibidores-
Palavras-chave: dc.subjectGlycine max-
Palavras-chave: dc.subjectMacrotyloma axiliare-
Título: dc.titlePurificação preparativa de inibidores Bowman-Birk, quantificação em alimentos e características imunogênicas dos inibidores da Glycine max e da Macrotyloma axillare-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
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