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Efeito do PSI na inibição do proteassoma 20S de Trypanosoma cruzi

Use este link compartilhar ou citar este material: http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/555848
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MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorCota, Renata Guerra de Sá-
Autor(es): dc.creatorHangai, Nilza Satie-
Data de aceite: dc.date.accessioned2019-11-06T13:27:45Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2019-11-06T13:27:45Z-
Data de envio: dc.date.issued2013-04-02-
Data de envio: dc.date.issued2013-04-02-
Data de envio: dc.date.issued2007-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://hdl.handle.net/123456789/2687-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/capes/555848-
Descrição: dc.descriptionAs proteases dos parasitos protozoários têm recebido um foco especial nas últimas décadas como potenciais alvos terapêuticos. Uma delas, o proteassoma 20S, é uma protease compartimentalizada que tem um papel crucial na biologia celular, regulando vários processos, dentre eles, a degradação de proteínas de meia vida curta, a progressão do ciclo celular e a apresentação de antígenos. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo geral avaliar o padrão de expressão e a atividade peptidásica desta protease, bem como o impacto da inibição do proteassoma com PSI, um inibidor clássico da atividade quimotripsina, na proliferação in vitro e na evolução da infecção experimental de camundongos Swiss inoculados com as cepas Y, Berenice-62 e Berenice-78 de Trypanosma cruzi. A análise por RT-PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para as subunidades catalíticas do proteassoma 20S (semelhantes à caspase, tripsina e quimotripsina), RNA total das formas epimastigotas obtidas das cepas Y, Be-62 e Be- 78, e do gene hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase como normalizador, mostraram níveis equivalententes de mRNA para estas subunidades. Por outro lado, utilizando a técnica de Western blot e anticorpos específicos para as subunidades do tipo alfa (1, 2, 3, 5, 6 e 7), foi evidenciada uma maior abundância de proteassoma 20S na cepa Be-78 quando comparada às cepas Y e Be-62. Estas diferenças nas quantidades absolutas de proteassoma foram confirmadas pela medida das respectivas atividades peptidásicas, utilizando susbtratos específicos e uma fração enriquecida de proteassoma. Os nossos resultados confirmam a atividade tripsina como a principal em epimastigota de T. cruzi e também sugerem que esta protease pode ser regulada por mecanismos póstranscricionais. A seguir, para a avaliação do efeito da inibição do proteassoma na replicação das formas epimastigota ao meio LIT contendo 3x106 parasitos, foram adicionadas concentrações que variaram entre 0,033 a 50μM de PSI. Foi observada uma redução da proliferação de 90% para as cepas Y e Be-78 quando comparados aos grupos controles. Entretanto, a cepa Be-62 apresentou uma redução da proliferação de 57% na concentração de 0,033μM e de 73% na concentração de 0,083μM. Esses resultados sugerem que um proteassoma funcional é essencial para a replicação das formas epimastigotas. Posteriormente, estes parasitos foram analisados por microscopia eletrônica de varredura. Foi observado o desligamento do corpo celular do parasito do seu flagelo, rugosidade acentuada em suas membranas celulares, bem como deformações na parte anterior do corpo celular, sugerindo que a inibição do proteassoma induz um desequilíbrio no turnover das proteínas envolvidas na manutenção do corpo do parasito. Finalmente foi analisado o efeito da inibição do proteassoma na evolução da infecção experimental da Doença de Chagas. Inicialmente, os tripomastigotas sanguíneos foram incubados com 100μM de PSI durante 20 minutos e posteriormente 5x103 parasitos foram inoculados em camundongos Swiss. Foi observada uma redução do número de parasitos de 68%, 42%, 73% no pico de parasitemia das cepas Y, Be-62 e Be-78, respectivamente. Esses resultados corroboram as diferenças bioquímicas iniciais observadas entre o proteassoma destas cepas. A análise do parasitismo tecidual e do processo de inflamação no baço, fígado músculo cardíaco e esquelético mostrou que na cepa Y o grau de parasitismo dos camundongos infectados com tripomastigotas pré-incubadas com PSI foi maior quando comparado ao grupo controle, porém, com um processo inflamatório que não acompanhou este quadro. Entretanto, quando foi utilizada a cepa Be-62, foi observado um aumento acentuado do parasitismo no fígado e baço acompanhados por uma exacerbação do processo inflamatório, quando comparado ao grupo controle. Este padrão não foi observado para a cepa Be-78, que apresentou comparada ao grupo controle, uma manutenção do padrão de parasitismo tecidual bem como do processo inflamatório. Em conjunto, nossos dados sugerem que o proteassoma é essencial para a manutenção do ciclo biológico do T. cruzi, uma vez que a inibição desta protease na fase replicativa (epimastigota), além de bloquear o ciclo celular, induz alterações morfológicas, enquanto que uma inibição na fase infectiva, compromete a progressão da infecção experimental. __________________________________________________________________________________________-
Descrição: dc.descriptionABSTRACT: In recent decades the proteases of protozoa parasites have emerged as potential therapeutic targets. One of them, the 20S proteasome, is a self-compartimentalizing protease that plays a crucial role in cell biology regulating several cellular processes including proteins degradation, cell-cycle control, and antigens presentation. In this sense, the main objective of this work was to evaluate the pattern of gene expression as well as peptidase activities of this protease and the impact of proteasome inhibition by PSI, a potent and reversible inhibitor of chymotrypsin-like activity on the proliferation in vitro and in the development of experimental infection of Swiss mice inoculated with the Y, Berenice-62 e Berenice-78 strains of Trypanosma cruzi. The analysis by RT-PCR, using oligonucleotides specific to the catalitic subunits of proteasome 20S (similar to caspase, tripsin and chymotripinsin), total RNA of the epimastigote forms from the Y, Be-62 and Be-78 strains, and from the gene hypoxantine-guanine phosphoribosytransferase as a normalizer, showed equivalent levels of mRNA to these subunits. On the other hand, the levels of proteasome analyzed by Western immunoblotting using an antibody to alfa subunit (1, 2, 3, 5, 6 and 7) were higher for strain Be-78 when compared to the strains Y and Be-62. These differences in the proteasome amount in these strains were confirmed for measurement of proteolytic activities associated to these subunits using specific fluorogenic substrates and an enriched fraction of the proteasome obtained from the same strains. Our results showed that the main proteasome activity is trypsin-like activity in epimastigote forms of T. cruzi, suggesting that post- transcriptional regulation may modulates the proteolytic activity in T. cruzi. For an evaluation of the proteasome inhibition in parasite replication ability we used epimastigote, in the presence of 0033μM to 50μM of the PSI. It was observed a reduction of the proliferation of 90% for the Y and Be-78 strains when compared to control groups. However, the Be-62 strain presented 57% of proliferation reduction in the concentration of 0,033μM and 73% in the concentration of 0,083μM. These results suggest that a functional proteasome is essential for the replication of epimastigote forms. Subsequently, these parasites were analyzed by the scanning electron microscopy. We observed that the flagellum was detached from the parasite cell body; roughness appeared on the parasite’s cell membranes, besides several others body cell deformations. These results suggest that the proteasome inhibition led to unbalanced of turnover of the proteins involved in the maintenance of the cell. Finally the effect of proteasome inhibition in the development of experimental infection of Chagas Disease was examined. Initially, young (15/18g), female, outbred Swiss mice were intraperitoneally inoculated with 5x103 trypomastigotes of the Y, Be-62 and Be-78 strains in the presence of 100uM of PSI. A reduction of 68, 42 and 73% on the peaks of parasitemia of these strains were corroborating the initial biochemical differences observed between the proteasome of these strains. The analysis of the tissue parasitism inflammation in the spleen, liver, heart and skeletal muscle showed that with Y strain, the level degree of parasitism of mice infected with tripomastigote pre-incubated with PSI,. However, higher tissue parasitism and intense inflammatory processes were observed in all tissue infected with Be-62 strain. This pattern was not observed for Be- 78 strain that maintained the same tissue parasitism and inflammatory process when compared to the control group. Taken together, our results suggest that the proteasome is essential for the maintenance of the T. cruzi life cycle, since that the protease inhibition during epimastigote division, in addition to cell cycle blocking induces morphological changes, while the inhibition of infective forms leads to changes in the development of the experimental infection.-
Idioma: dc.languagept_BR-
Publicador: dc.publisherPrograma de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.-
Palavras-chave: dc.subjectTrypanosoma cruzi - genoma-
Palavras-chave: dc.subjectProtozoologia-
Palavras-chave: dc.subjectTriponossomose - tratamento-
Palavras-chave: dc.subjectBiologia molecular-
Título: dc.titleEfeito do PSI na inibição do proteassoma 20S de Trypanosoma cruzi-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional - UFOP

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