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Construção de interruptores genéticos baseados em serina integrases para controle da expressão gênica em células de mamíferos
Use este link compartilhar ou citar este material: http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/1119099
Registro completo de metadados
| Metadados | Descrição | Idioma |
|---|---|---|
| Autor(es): dc.contributor | Rech Filho, Elíbio Leopoldo | - |
| Autor(es): dc.creator | Sales, Thais Torquato | - |
| Data de aceite: dc.date.accessioned | 2025-09-01T11:58:52Z | - |
| Data de disponibilização: dc.date.available | 2025-09-01T11:58:52Z | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2025-04-16 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2025-04-16 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2025-04-16 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2024-12-18 | - |
| Fonte completa do material: dc.identifier | http://repositorio.unb.br/handle/10482/52055 | - |
| Fonte: dc.identifier.uri | http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/1119099 | - |
| Descrição: dc.description | Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2024. | - |
| Descrição: dc.description | As serina integrases são proteínas de bacteriófagos responsáveis pela integração do DNA viral no genoma bacteriano. Essa inserção ocorre por meio de uma sequência denominada attP (phago attachment site), com o DNA bacteriano em um sítio denominado attB (bacterial attachment site). Após a recombinação mediada pela integrase, o DNA viral é incorporado ao genoma da bactéria, os sítios são mesclados, e os novos sítios attL (left attachment site) e attR (right attachement site) são formados. Quando os sítios attB e attP são posicionados em sentidos opostos flanqueando uma sequência gênica de interesse, os sítios reconhecidos pela serina integrase faz uma inversão da sequência, ou seja, realiza um giro de 180° no DNA que se encontra entre os dois sítios, resultando na posição reverso complementar à inicial. Diversas serina integrases já foram utilizadas para controlar um gene repórter em células procarióticas. No entanto, a utilização de integrases em células eucarióticas como ferramenta para regulação da expressão gênica ainda é limitada. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a funcionalidade de seis integrases no controle da expressão gênica em células de mamíferos, visando a construção de um interruptor genético. Células de fibroblastos de pele bovina foram transfectadas com as seis integrases (Int2, Int4, Int5, Int7, Int9 e Int13) em um sistema de cotransfecção plasmidial, como segue: um vetor de expressão da integrase nomeado como pIE e um segundo vetor contendo a sequência codificadora (CDS) do gene repórter gfp em orientação reverso complementar, flanqueado pelos sítios attB/attP da respectiva integrase, intitulado pSG. Após a cotransfecção, as células foram incubadas durante 48 h e acúmulo de GFP foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência e mensurada por citometria de fluxo. A inversão da CDS foi amplificada por meio da PCR e confirmada por sequenciamento do tipo Sanger. A florescência da GFP foi detectada por microscopia e citometria para Int9 e Int13. além disso, o sequenciamento evidenciou a correta inversão do gfp e a formação dos sítios attL/attR previstos para todas as integrases avaliadas. | - |
| Descrição: dc.description | Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Biosyn (INCT- Biosyn) | - |
| Descrição: dc.description | Serine integrases are bacteriophage proteins responsible for the integration of viral DNA into the bacterial genome. This insertion occurs via a sequence called attP (phage attachment site), with the bacterial DNA at a site called attB (bacterial attachment site). After recombination mediated by the integrase, the viral DNA is incorporated into the bacterial genome, the sites are merged, and new sites attL (left attachment site) and attR (right attachment site) are formed. When the attB and attP sites are positioned in opposite orientations flanking a target gene sequence, the sites recognized by the serine integrase perform a sequence inversion, rotating the DNA located between the two sites by 180°, resulting in a reverse complementary orientation relative to the original. Various serine integrases have already been used to control a reporter gene in prokaryotic cells. However, the use of integrases in eukaryotic cells as a tool for gene expression regulation remains limited. Thus, the aim of this study was to evaluate the functionality of six integrases in controlling gene expression in mammalian cells, aiming to construct a genetic switch. Bovine skin fibroblast cells were transfected with the six integrases (Int2, Int4, Int5, Int7, Int9, and Int13) in a plasmid cotransfection system, as follows: an integrase expression vector named pIE and a second vector containing the coding sequence (CDS) of the reporter gene gfp in reverse complementary orientation, flanked by attB/attP sites of the respective integrase, titled pSG. After cotransfection, the cells were incubated for 48 h, and GFP accumulation was assessed by fluorescence microscopy and measured by flow cytometry. The CDS inversion was amplified by PCR and confirmed by Sanger sequencing. GFP fluorescence was detected by microscopy and cytometry for Int9 and Int13. Additionally, sequencing confirmed the correct inversion of gfp and the formation of the expected attL/attR sites for all evaluated integrases. | - |
| Descrição: dc.description | Instituto de Ciências Biológicas (IB) | - |
| Descrição: dc.description | Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade (Rede PRÓ-CENTRO-OESTE) | - |
| Formato: dc.format | application/pdf | - |
| Idioma: dc.language | pt_BR | - |
| Direitos: dc.rights | Acesso Aberto | - |
| Direitos: dc.rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Bacteriófago | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Circuitos genéticos | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Interruptores genéticos | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Serina integrases | - |
| Título: dc.title | Construção de interruptores genéticos baseados em serina integrases para controle da expressão gênica em células de mamíferos | - |
| Tipo de arquivo: dc.type | livro digital | - |
| Aparece nas coleções: | Repositório Institucional – UNB | |
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