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Desenvolvimento de teste usando qPCR para detecção de HPV : protótipo para identificação de HPV 16 e 18.
Use este link compartilhar ou citar este material: http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/1027232
Registro completo de metadados
| Metadados | Descrição | Idioma |
|---|---|---|
| Autor(es): dc.contributor | Silva, Glenda Nicioli da | - |
| Autor(es): dc.contributor | Silva, Glenda Nicioli da | - |
| Autor(es): dc.contributor | Rocha, Ana Maria Sampaio | - |
| Autor(es): dc.contributor | Belo, Vanessa de Almeida | - |
| Autor(es): dc.creator | Pereira, Isadora Oliveira Ansaloni | - |
| Data de aceite: dc.date.accessioned | 2025-08-21T15:54:40Z | - |
| Data de disponibilização: dc.date.available | 2025-08-21T15:54:40Z | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2024-09-30 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2024-09-30 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2023 | - |
| Fonte completa do material: dc.identifier | https://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/18679 | - |
| Fonte: dc.identifier.uri | http://educapes.capes.gov.br/handle/capes/1027232 | - |
| Descrição: dc.description | Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. | - |
| Descrição: dc.description | O câncer cervical representa uma importante barreira à qualidade de vidas das mulheres, sendo o 4° câncer mais comum no mundo, com 85% dos casos diagnosticados em países em desenvolvimento. A infecção persistente por HPV de alto risco oncogênico é um fator fundamental, mas não único, ao seu desenvolvimento, podendo levar a lesões celulares que podem evoluir a neoplasia. O câncer do colo do útero pode ser prevenido por estratégias de rastreamento, que visam o diagnóstico de lesões precursoras e de tumores em estágios precoces. Dada a relação causal entre a infecção por HPV e o câncer cervical, justifica-se o desenvolvimento de métodos moleculares para a identificação de DNA-HPV, que podem ser utilizados em programas de rastreamento do câncer cervical. Recomenda-se essa estratégia por sua maior sensibilidade, valor preditivo negativo e custo-efetividade quando comparada a outros métodos. Entretanto, testes comerciais para a identificação de HPV por PCR (a técnica molecular mais utilizada), no geral, focam em genotipagem e apresentam alto custo. Esse trabalho objetiva o desenvolvimento e de um método de PCR em tempo real (qPCR) utilizando SYBR Green para detecção genérica do HPV, visando um método com alta sensibilidade e menores custos. Os resultados obtidos através desse método foram comparados a um kit comercial, validado para uso em pesquisa, para a detecção de hrHPV. Para tal, testou-se a sensibilidade do par de primers generalistas GP5+/6+ para a detecção de hrHPV e sua adequabilidade para utilização em qPCR. Para a padronização do método de qPCR, foram testadas diferentes reações, variando-se concentrações de primers, volume de amostra e perfis de ciclagem. Notou-se que uma baixa temperatura de anelamento e o uso de altas concentrações dos primers nas reações levam a melhores resultados. A qualidade de amplificação e a especificidade da reação foram avaliadas por meio de análises das curvas de amplificação e das curvas de melting. O protocolo padronizado foi de reações com volume final de 20 μL, concentração de primers de 5,0 μM, volume de amostra de 5 μL e perfil de ciclagem de: 50 °C por 2 minutos, 95 °C por 2 minutos e 45 ciclos de 95 °C por 15 segundos, 42,4 °C por 30 segundos e 60 °C por 1 minuto. Esse protocolo levou a curvas de amplificação com caráter exponencial definido, curvas de melting com picos definidos e faixas de temperatura de melting entre 73 e 79 °C (caracterizando amplificação HPV-específica), porém sensibilidade relativa de 43,24% para a detecção de hrHPV quando comparado ao teste comercial. A variação nos parâmetros da reação não resultou em aumento expressivo nas taxas de amplificação. A sensibilidade relativa para detecção de HPV 16 e 18 foi de 94,12%. Uma reação de qPCR para identificação do gene da β-actina foi padronizada para uso como controle interno da reação. Dada a baixa taxa de amplificação de amostras hrHPV positivas, o protocolo proposto não se mostra uma boa alternativa para testagem primária nos programas de rastreamento do câncer cervical, porém pode ser avaliado para aplicação em pesquisa para a detecção de HPV 16 e 18, possibilitando a diferenciação dos tipos pela temperatura de melting de cada produto. | - |
| Descrição: dc.description | Cervical cancer poses a significant barrier to the quality of life for women, being the 4th most common cancer worldwide, with 85% of cases diagnosed in developing countries. Persistent infection with high-risk oncogenic HPV is a key factor, but not the only one, in its development, potentially leading to cellular lesions that can progress to neoplasia. Cervical cancer can be prevented through screening strategies aimed at the diagnosis of precursor lesions and early-stage tumors. Given the causal relationship between HPV infection and cervical cancer, the development of molecular methods for HPV-DNA detection is supported to be used in cervical cancer screening programs. This strategy is recommended for its higher sensitivity, negative predictive value, and cost-effectiveness when compared to other methods. However, commercial tests for HPV detection by PCR (the most widely used molecular technique) generally focus on genotyping and are expensive. This study aims to develop a real-time PCR (qPCR) method using SYBR Green for generic HPV detection, targeting a method with high sensitivity and lower costs. The results obtained through this method were compared to a commercially validated research-use kit for hrHPV detection. To this end, the sensitivity of the GP5+/6+ generalist primer pair for hrHPV detection and its suitability for use in qPCR were tested. For the standardization of the qPCR method, different protocols were tested, varying primer concentrations, sample volumes, and cycling profiles. It was observed that a low annealing temperature and the use of high primer concentrations in the reactions led to better results. The amplification quality and specificity of the reaction were evaluated through analyses of the amplification curves and melting curves. The standardized protocol involved reactions with a final volume of 20 μL, primer concentration of 5.0 μM, sample volume of 5 μL, and a cycling profile of: 50 °C for 2 minutes, 95 °C for 2 minutes, and 45 cycles of 95 °C for 15 seconds, 42.4 °C for 30 seconds, and 60 °C for 1 minute. This protocol resulted in amplification curves with defined exponential character, melting curves with distinct peaks, and melting temperature ranges between 73 and 79 °C (characterizing HPV-specific amplification), but a relative sensitivity of 43.24% for hrHPV detection compared to the commercial test. Variations in reaction parameters did not result in a significant increase in amplification rates. The relative sensitivity for HPV 16 and 18 detection was 94.12%. A qPCR reaction for the identification of the β-actin gene was standardized for use as an internal control of the reaction. Given the low amplification rate of hrHPV-positive samples, the proposed protocol does is not suitable for primary testing in cervical cancer screening programs. However, it may be evaluated for research purposes in the detection of HPV 16 and 18, allowing type differentiation through the melting temperature of each product. | - |
| Formato: dc.format | application/pdf | - |
| Idioma: dc.language | pt_BR | - |
| Direitos: dc.rights | aberto | - |
| Direitos: dc.rights | Attribution 3.0 United States | - |
| Direitos: dc.rights | http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/us/ | - |
| Direitos: dc.rights | Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 11/09/2024 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que sejam citados o autor e o licenciante. | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Diagnóstico molecular | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Reação em cadeia da polimerase em tempo real | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Papilomavirus | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Câncer - colo uterino | - |
| Título: dc.title | Desenvolvimento de teste usando qPCR para detecção de HPV : protótipo para identificação de HPV 16 e 18. | - |
| Tipo de arquivo: dc.type | livro digital | - |
| Aparece nas coleções: | Repositório Institucional - UFOP | |
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