Estudo das proteínas AIF e C5orf63 e suas possíveis funções redox

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Autor(es): dc.contributorNakao, Lia Sumie-
Autor(es): dc.contributorUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia-
Autor(es): dc.creatorLo, Sze Mei, 1993--
Data de aceite: dc.date.accessioned2021-03-09T21:15:28Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2021-03-09T21:15:28Z-
Data de envio: dc.date.issued2021-02-22-
Data de envio: dc.date.issued2021-02-22-
Data de envio: dc.date.issued2019-
Fonte completa do material: dc.identifierhttps://hdl.handle.net/1884/69415-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/1884/69415-
Descrição: dc.descriptionOrientadora: Profa. Dra. Lia Sumie Nakao-
Descrição: dc.descriptionTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica. Defesa : Curitiba, 10/12/2019-
Descrição: dc.descriptionInclui referências: p. 87-92-
Descrição: dc.descriptionResumo: As proteínas redox, as quais possuem funções intermediadas pelas modificações dos resíduos de cisteínas, são de grande importância para a fisiologia celular. Na primeira parte desse trabalho foi estudado o apoptosis-inducing fator (AIF), uma flavoproteína encontrada na membrana interna mitocondrial voltada para o espaço intermembranas. Ela é conhecida pela sua atividade apoptótica, independente da via das caspases. Sob estímulo apoptótico é clivada proteoliticamente na mitocôndria e translocada para o núcleo promovendo degradação do DNA em larga escala. Entretanto, em condições fisiológicas AIF pode estar envolvida no complexo I da cadeia transportadora de elétrons, sendo importante para a fosforilação oxidativa. A AIF possui três resíduos de cisteína na sua forma madura. Esse aminoácido pode sofrer modificações no seu grupo tiol (-SH). A hipótese é que essas cisteínas oxidadas a dissulfeto possam ter algum papel na função de AIF. Portanto, foram utilizadas abordagens in vitro de proteína recombinante e em cultivo celular para investigar o possível papel das cisteínas da AIF. A proteína recombinante incubada com 0,5 mM de diamida, um oxidante de tiol a dissulfeto, induziu a formação de bandas com migração eletroforética de aproximadamente 70 e 170 kDa em géis não redutores, essas bandas desaparecem em condições redutoras. Esse mesmo efeito foi observado em modelo celular superexpressando AIF-HA exógena tratada com 75 pM de diamida e 500 pM de peróxido de hidrogênio. Entretanto, foi observado nos dois modelos de estudo que a mutação de qualquer um dos três resíduos de cisteínas presentes na AIF leva à diminuição e até completa ausência desses conjugados ligados por dissulfeto (CLD). Os dados de espectrometria de massas dos fragmentos de AIF digeridos por tripsina confirmaram que todas as três cisteínas são oxidáveis. Investigamos se a proteína redox tiorredoxina 1 (Trx1), previamente descrita como parceiro molecular de AIF, seria capaz de reduzir os dissulfetos dos CLD de AIF. Os resultados tanto em modelo in vitro quanto em modelo celular dão indícios de que Trx1 é capaz de desfazer os CLD. Na segunda parte desse trabalho foi investigado a proteína possivelmente redox, glutaredoxin-like, C5orf63 (humana) e YDR286C (levedura), que apresenta domínio CxxC (duas cisteínas intercaladas por dois aminoácidos). Dados computacionais demonstraram que C5orf63 e YDR286C são homólogas ortólogas e possuem um peptídeo-sinal de endereçamento para mitocôndria. A localização mitocondrial foi confirmada usando um construto com GFP, tanto em células humanas quanto em leveduras. Ambas as proteínas são pouco solúveis quando expressas em bactérias e leveduras. Os resultados preliminares mostraram que C5orf63 apresenta termoestabilidade e uma possível atividade peroxidásica, mas não apresentou atividade de glutarredoxina, analisada pelo ensaio HED. As leveduras com deleção do gene da YDR286C crescem similarmente ao selvagem, mesmo sob condições oxidantes de peróxido de hidrogênio ou diamida, mas apresentaram menor longevidade quando comparadas às leveduras selvagens. Portanto, esses dados indicam que C5orf63 e YDR286C não são proteínas essenciais e podem ter um papel a fisiologia mitocondrial. Palavras-chave: Apoptosis-inducing factor, cisteína, mitocôndria, tiorredoxina, C5orf63, YDR286C.-
Descrição: dc.descriptionAbstract: Redox proteins, whose functions depends on modifications in cysteine residues, are important for cell physiology. In the first part of this work, we studied apoptosisinducing factor (AIF), a flavoprotein present in mitochondrial inner membrane facing the intermembrane space. It is known for its apoptotic activity, independent of caspases. Upon apoptotic stimulus it is proteolytically cleaved and translocated to the nucleus promoting large-scale DNA degradation. However, under physiological conditions, AIF may be involved in electron transport chain complex and is important for oxidative phosphorylation. The mature form of AIF has three cysteine residues. This aminoacid is susceptible to changes in its thiol group (-SH). Here, we hypothesized that cysteine oxidation to disulfide might have a role in AIF function. Therefore, in vitro approaches with recombinant proteins and cell culture were used to evaluate oxidation of AIF cysteines. The recombinant protein incubated with 0.5 mM diamide, a known thiol oxidant to disulfide, induced the appearance of bands with electrophoretic migration of approximately 70 and 170 kDa in nonreducing gels, that disappear under reducing conditions. This same effect was observed in the cellular model overexpressing AIF-HA treated with 75 pM diamide or 500 pM hydrogen peroxide. However, it was observed in this two models that mutation of any of the three AIF cysteines leads to the decrease and even absence of these disulfidelinked conjugates (DLC). Mass spectrometry data from trypsin-digested AIF fragments confirmed that all three cysteines are oxidizable. We investigated whether redox protein thioredoxin 1 (Trx1), molecular partner of AIF, could reduce AIF's DCL disulfides. Both the in vitro and cellular models indicated that Trx1 is capable of reducing DCL. In the second part, we investigated a possible redox protein, glutaredoxin-like, C5orf63 (human) or YDR286C (yeast), which has CxxC domain (two cysteines separated by two amino acids). Computational data demonstrated that C5orf63 and YDR286C are orthotic homologues and have a mitochondrial peptide signal. The mitochondrial localization was confirmed by using a construct with GFP, in both mammalian and yeast cells. Both proteins are weakly soluble, when expressed in bacterial and yeast system. The preliminary results showed that C5orf63 presents thermostability and a possible peroxidase activity, but no glutaredoxin activity, analysed by the HED assay. Yeast lacking YDR286C gene grow similarly to wild-type, even under oxidative conditions, induced by hydrogen peroxide or diamide, but seem to decreased life span compared to wt yeast. Thus, these data indicate that C5orf63 anf YDR286C are not essential proteins, that might have a role in mitochondria physiology. Keywords: Apoptosis-inducing factor 1 (AIF1), thioredoxin 1 (Trx1), mitochondria, C5orf63, YDR286C.-
Formato: dc.format118 p. : il. (algumas color.).-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
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Palavras-chave: dc.subjectCisteína-
Palavras-chave: dc.subjectMitocondria-
Palavras-chave: dc.subjectProteínas-
Palavras-chave: dc.subjectMicrobiologia-
Título: dc.titleEstudo das proteínas AIF e C5orf63 e suas possíveis funções redox-
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