Caracterização de enxertos valvares porcinos obtidos por dois processos de descelularização e avaliação da sua biocompatibilidade in vitro usando células humanas e vesículas extracelulares

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Autor(es): dc.contributorDominguez, Alejandro Correa-
Autor(es): dc.contributorStimamiglio, Marco Augusto-
Autor(es): dc.contributorUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular-
Autor(es): dc.creatorLeitolis, Amanda, 1988--
Data de aceite: dc.date.accessioned2020-09-24T17:34:08Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2020-09-24T17:34:08Z-
Data de envio: dc.date.issued2020-06-24-
Data de envio: dc.date.issued2020-06-24-
Data de envio: dc.date.issued2019-
Fonte completa do material: dc.identifierhttps://hdl.handle.net/1884/67218-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/1884/67218-
Descrição: dc.descriptionOrientador: Prof. Dr. Alejandro Correa Dominguez-
Descrição: dc.descriptionCoorientador: Prof. Dr. Marco Augusto Stimamiglio-
Descrição: dc.descriptionTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 21/10/2019-
Descrição: dc.descriptionInclui referências: p. 106-119-
Descrição: dc.descriptionResumo: Doenças de válvula cardíaca (DCV) ou valvopatias são termos utilizados para designar tipos diferentes de problemas que podem afetar a funcionalidade de qualquer uma das quatro válvulas do coração. A principal forma de tratamento para portadores de DVC é a cirurgia de substituição valvar, um procedimento no qual são aplicados substitutos valvares como as próteses biológicas. A descelularização, técnica para remoção do conteúdo celular tecidual e retenção da estrutura da matriz extracelular (MEC), é uma das estratégias para o desenvolvimento de próteses viáveis, não imunogênicas e funcionais. Neste trabalho, válvulas cardíacas pulmonares porcinas foram descelularizadas utilizando uma solução de 0,1% SDS e 0,02% EDTA (grupo VPD-S) ou através da utilização desta mesma solução seguida de exposição à solução hipertônica e incubação com 20 U/mL de Benzonase (grupo VPD-B). Após os tratamentos, a eficiência de descelularização de cada protocolo foi avaliada por meio da extração e quantificação de DNA residual dos tecidos. Além disso, a MEC valvar foi caracterizada e avaliada quanto ao seu potencial citotóxico, imunogênico e de biocompatibilidade com células humanas. Posteriormente, vesículas extracelulares derivadas de explante cardíaco (hH-EVs) foram caracterizadas fisicamente, tiveram seu conteúdo proteico analisado por espectrometria de massa (MS) e foram avaliadas quanto (1) a sua capacidade de influenciar a adesão, migração, proliferação e angiogênese de células endoteliais (HUVEC) e de células-tronco mesenquimais (CTMs); e (2) de favorecer a recelularização de válvulas descelularizadas. Nossos resultados mostraram que os enxertos do grupo VPD-S apresentaram aproximadamente 40% menos DNA no conduto e no músculo valvar, e não alteraram a quantidade de DNA das cúspides em comparação ao controle nativo, ao passo que nos enxertos do grupo VPD-B a remoção do DNA das válvulas foi superior a 93%. Entretanto, nesse último grupo, maiores alterações na MEC valvar foram verificadas. Nenhum dos enxertos foi citotóxico ou capaz de induzir a proliferação de células imunes in vitro. Em ensaios de biocompatibilidade in vitro, tecidos VPD-S co-cultivados com CTMs apresentaram recelularização significativamente maior que VPD-B após 7 e 15 dias. Entretanto, a recelularização com células intersticiais de válvula cardíaca (VIC) foi semelhante em ambos os grupos. Quanto às hH-EVs, a análise por MS identificou um total de 1248 proteínas e a análise de ontologia gênica (GO) revelou proteínas envolvidas em processos como, regulação da morte celular e a resposta à cicatrização. Além disso, hH-EVs foram capazes de estimular a migração e diminuir a adesão de CTMs, além de induzir a proliferação e a angiogênese in vitro de HUVEC. Quando testadas em modelo de co-cultivo, as hH-EVs aumentaram significativamente a recelularização de válvulas descelularizadas com CTMs após 3 e 7 dias. Em resumo, esse conjunto de dados demonstra que os protocolos de descelularização resultaram em próteses valvares não tóxicas, com quantidades reduzidas de DNA e receptivas a recelularização com células humanas. Além disso, os dados obtidos confirmam que as hH-EVs são capazes de modular processos celulares e são úteis para aplicação em engenharia de tecidos. Palavras-chave: Válvula cardíaca 1. Descelularização 2. Vesículas extracelulares 3.-
Descrição: dc.descriptionAbstract: Heart valve diseases (HVD) comprise different types of problems that may affect the functionality of the heart valves. The main treatment for patients with HDV is valve replacement surgery, a procedure in which valve substitutes, such as biological prostheses, are applied. Decellularization, a technique for removing cell content from a tissue while maintain the extracellular matrix (ECM) structure, is one of the strategies for the development of viable, non-immunogenic and functional prostheses. In this work, porcine pulmonary heart valves were decellularized using a 0.1% SDS and 0.02% EDTA solution (VPD-S group) or using the same solution followed by exposure to hypertonic solution and incubation with 20 U/mL of Benzonase (VPD-B group). After the treatments, the decellularization efficiency of each protocol was evaluated by DNA extraction and quantification. The decellularized ECMs were characterized and analyzed to determine their cytotoxicity, immunogenicity and biocompatibility with human cells. Subsequently, heart explantderived extracellular vesicles (hH-EVs) were physically characterized and the protein content in these particles was evaluated by mass spectrometry (MS). The potential of hH-EVs to (1) induce proliferation, adhesion, angiogenesis and wound healing in mesenchymal stem-cells (MSC) and endothelial cells (HUVEC), as well as, the potential to (2) improve the recellularization of decellularized valves was investigated in vitro. Our results showed that the VPD-S group grafts presented 40% less DNA in conduit and muscle of valve in comparison to the native control. On the other hand, the procedure used in VPD-B group led to DNA reduction greater than 93%. However, in VPD-B valves major changes in ECM structure were observed. Also, both grafts produced were non-cytotoxic and were unable to induce proliferation of immune cells in vitro. In vitro biocompatibility assays showed that VPD-S tissues cocultured with MSCs presented significantly greater recellularization than VPD-B after 7 and 15 days. However, recellularization with valve interstitial cells (VIC) was similar between groups. For hH-EVs, MS analysis identified a total of 1248 proteins and the gene ontology (GO) analysis revealed proteins involved in processes such as cell death regulation and wound healing response. In addition, hH-EVs were able to induce proliferation and angiogenesis in HUVEC, improve wound healing and reduce MSC adhesion. Last, we showed that hH-EVs were able to significantly promote MSC recellularization of decellularized valves after 3 and 7 days. In summary, our data demonstrates that decellularization protocols generated porcine valve prostheses with reduced amounts of DNA, non-cytotoxic and able to be recellularized with human cells. In addition, the data confirm the potential of hH-EVs to modulate cellular processes and for tissue engineering applying. Keywords: Heart valve 1. Decellularization 2. Extracellular vesicles 3.-
Formato: dc.format126 p. : il. (algumas color.).-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
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Palavras-chave: dc.subjectProtese das valvas cardiacas-
Palavras-chave: dc.subjectCitologia e biologia celular-
Palavras-chave: dc.subjectBiologia molecular-
Título: dc.titleCaracterização de enxertos valvares porcinos obtidos por dois processos de descelularização e avaliação da sua biocompatibilidade in vitro usando células humanas e vesículas extracelulares-
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