Construção e expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab de Azospirillum brasiliense

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Autor(es): dc.contributorSouza, Emanuel Maltempi de, 1964--
Autor(es): dc.contributorAraújo, Luíza Maria de-
Autor(es): dc.contributorUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências Biológicas-
Autor(es): dc.creatorSotomaior, Patricia-
Data de aceite: dc.date.accessioned2025-09-01T11:28:23Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2025-09-01T11:28:23Z-
Data de envio: dc.date.issued2022-09-06-
Data de envio: dc.date.issued2022-09-06-
Data de envio: dc.date.issued2009-
Fonte completa do material: dc.identifierhttps://hdl.handle.net/1884/30309-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/1884/30309-
Descrição: dc.descriptionOrientador: Emanuel Maltempi de Souza-
Descrição: dc.descriptionCoorientadora: Luíza Maria de Araújo-
Descrição: dc.descriptionMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências Biológicas-
Descrição: dc.descriptionResumo : A fixação biológica de nitrogênio é fundamental para disponibilizar este elemento em uma forma que seja metabolicamente utilizável pela maioria dos organismos. Nas bactérias diazotróficas, que são capazes de fixar nitrogênio, a transcrição dos genes envolvidos neste processo é ativada pela proteína NifA, que tem sua atividade controlada pelos níveis de amônio e oxigênio. Em Azotobacter vinelandii, os genes nifLA estão agrupados em um operon; a proteína NifA tem atividade constitutiva, mas é inativada por NifL em altas concentrações de amônio e/ou oxigênio. Por outro lado, em Azospirillum brasilense, apenas o gene que codifica para a proteína NifA está presente e, neste caso, a própria proteína NifA responde às alterações dos níveis de amônio e oxigênio, através de um mecanismo que envolve sua auto-inibição via o domínio N-terminal. A proteína NifA de A. brasilense é composta por três domínios separados por duas regiões interdomínios. O domínio N-terminal está relacionado com o controle da atividade da proteína por amônio enquanto que a sensibilidade ao oxigênio está relacionada ao interdomínio que conecta o domínio central ao domínio C-terminal. O domínio central é responsável pela interação com a RNA polimerase e ativação da transcrição, enquanto o domínio C-terminal interage com seqüências específicas de DNA. Para estudar o mecanismo de regulação da atividade da proteína NifA de A. brasilense e obter uma proteína NifA insensível aos níveis de amônio foram construídos dois genes quiméricos: nifAQ1Ab, que codifica o domínio N-terminal da proteína NifA de A. brasilense ligado ao domínio central + C-terminal da proteína NifA de A. vinelandii, e nifAQ2Ab, que codifica o domínio N-terminal da proteína NifA de A. vinelandii ligado ao domínio central + C-terminal da proteína NifA de A. brasilense. Fragmentos de DNA contendo as regiões de interesse foram obtidos por reação de PCR utilizando DNA genômino de A. brasilense e um plasmídeo contendo o gene nifA de A. vinelandii como moldes. Os produtos de PCR foram clonados separadamente no vetor pCR2.1. Após confirmação das seqüências de DNA clonadas, os insertos foram clivados com HindIII e XbaI e ligados no vetor pDK7. Em seguida, os genes quiméricos foram montados no vetor de expressão pET28a, unindo as regiões que correspondem aos domínios N-terminal de A. brasilense e central + C-terminal de A. vinelandii ou aos domínios N-terminal de A. vinelandii e central + C-terminal de A. brasilense. A partir da montagem dos genes quiméricos no vetor pET28a foi possível fazer a expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab em E. coli e determinar as melhores condições para sua solubilização. Os genes quiméricos foram construídos com sucesso e a expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab revelou a alta insolubilidade dessa proteína. Os ensaios de expressão mostraram que as melhores condições de expressão foram obtidas após indução a 37ºC a partir de 2 horas ou a 18ºC durante a noite, utilizando IPTG 0,5mmol/L ou lactose 0,5% como indutores.-
Formato: dc.format1 recurso online : PDF.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
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Relação: dc.relationExigências do sistema: Adobe Acrobat Reader-
Palavras-chave: dc.subjectAzospirillum brasilense-
Palavras-chave: dc.subjectBactérias nitrificantes-
Título: dc.titleConstrução e expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab de Azospirillum brasiliense-
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