Controle da atividade da enzima regulatória dinitrogenase redutase ADP - ribosiltransferase (DraT) pela proteína GLnB de Azospirillum brasilense

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Autor(es): dc.contributorSouza, Emanuel Maltempi de, 1964--
Autor(es): dc.contributorUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciencias Biológicas. Programa de Pós-Graduaçao em Bioquímica-
Autor(es): dc.contributorSantos, Marcelo Muller dos-
Autor(es): dc.contributorHuergo, Luciano Fernandes-
Autor(es): dc.creatorMoure, Vivian Rotuno-
Data de aceite: dc.date.accessioned2019-08-21T23:00:51Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2019-08-21T23:00:51Z-
Data de envio: dc.date.issued2013-08-06-
Data de envio: dc.date.issued2013-08-06-
Data de envio: dc.date.issued2013-08-06-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://hdl.handle.net/1884/29678-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/1884/29678-
Descrição: dc.descriptionResumo: A fixação biológica de nitrogênio é catalisada pelo complexo enzimático nitrogenase. Este complexo contém duas metaloproteínas: as proteínas Fe e MoFe e sofre modificação pós-traducional. Em Azospirillum brasilense, objeto deste estudo, a regulação pós-traducional envolve a modificação covalente de uma das subunidades da proteína Fe por ADP-ribosilação. Esta ADP-ribosilação inativa reversivelmente a proteína Fe e é catalisada pela DraT em resposta ao aumento de íons amônio ou depleção da energia celular. O grupo ADP-ribosil é removido pela DraG, promovendo reativação da proteína Fe e consequentemente, da nitrogenase. Além das proteínas DraT e DraG, as proteínas PII estão diretamente envolvidas neste processo de desligamento da nitrogenase. Neste trabalho são apresentados resultados referentes ao controle de DraT exercido pelas proteínas PII. Um protocolo alternativo para a purificação de PII nativas foi desenvolvido com a utilização de um tratamente térmico (80°C/15 min) anterior a injeção na coluna. Este tratamento térmico melhorou a homogeneidade da GlnB de A. brasilense de 70 para 99%. A alta estabilidade térmica foi uma característica comum de proteínas PII de várias Proteobactérias. Os valores de Tm utilizando Sypro Orange foram maiores do que 77°C. Experimentos 1H RMN mostraram que a GlnB de A. brasilense foi estável até 70°C. Além disso, experimentos 1H-15N TROSY confirmaram que as amostras de GlnB obtidas com e sem a etapa de tratamento térmico mantiveram a mesma conformação global. A partir destes resultados, o protocolo de purificação de proteínas PII de Proteobactérias foi desenvolvido com a utilização de uma etapa de tratamento térmico de 70°C/15 min anterior a injeção na coluna que promoveu aumento da homogeneidade de 70 para 95%, com maior quantidade de GlnB após cromatografia. Para avaliar o envolvimento de GlnB e GlnZ de A. brasilense na regulação de DraT, a proteína Fe de Azotobacter vinelandii foi utilizada como substrato para atividade in vitro de DraT complexada ou não com as proteínas PII. Nas condições estabelecidas, GlnB foi necessária para a atividade de DraT na presença de Mg-ADP. O efetor de PII 2-oxoglutarato, na presença de Mg-ATP, inibiu a atividade do complexo DraT-GlnB, possivelmente induzindo a dissociação do complexo. A DraT também foi ativada por GlnZ, bem como ambas proteínas uridililadas. Entretanto, uma variante com deleção parcial na volta T não foi capaz de ativar DraT, sugerindo que este seja o sítio de interação entre DraT e GlnB. Estudos cinéticos revelaram que o complexo DraT-GlnB de A. brasilense é, pelo menos, 18 vezes mais eficiente do que DraT purificada de R. rubrum, mas com um valor de Km para NAD+ similar. Finalmente, os resultados mostraram que a ADPribosilação da proteína Fe não afeta o estado eletrônico do seu centro metálico, mas impede a associação da proteína Fe com a MoFe, consequentemente inibindo a transferência de elétrons.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
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Palavras-chave: dc.subjectTeses-
Palavras-chave: dc.subjectAzospirillum brasiliense-
Palavras-chave: dc.subjectProteinas-
Título: dc.titleControle da atividade da enzima regulatória dinitrogenase redutase ADP - ribosiltransferase (DraT) pela proteína GLnB de Azospirillum brasilense-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
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