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Construção e avaliação de vetores de expressão heteróloga em Angomonas deanei
Use este link compartilhar ou citar este material: http://educapes.capes.gov.br/handle/1884/28094
Registro completo de metadados
| Metadados | Descrição | Idioma |
|---|---|---|
| Autor(es): dc.contributor | Rocha, Wanderson Duarte da | - |
| Autor(es): dc.contributor | Fragoso, Stenio Perdigão | - |
| Autor(es): dc.contributor | Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica) | - |
| Autor(es): dc.creator | Laibida, Leticia Adejani | - |
| Data de aceite: dc.date.accessioned | 2025-09-01T11:40:31Z | - |
| Data de disponibilização: dc.date.available | 2025-09-01T11:40:31Z | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2025-01-05 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2025-01-05 | - |
| Data de envio: dc.date.issued | 2012 | - |
| Fonte completa do material: dc.identifier | https://hdl.handle.net/1884/28094 | - |
| Fonte: dc.identifier.uri | http://educapes.capes.gov.br/handle/1884/28094 | - |
| Descrição: dc.description | Orientador : Prof. Dr. Wanderson Duarte da Rocha | - |
| Descrição: dc.description | Coorientador : Prof. Dr. Stenio perdigão Fragoso | - |
| Descrição: dc.description | Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/02/2012 | - |
| Descrição: dc.description | Bibliografia: fls. 91-100 | - |
| Descrição: dc.description | Resumo | - |
| Descrição: dc.description | Resumo: Os tripanossomatídeos são protozoários parasitos ancestrais com características genéticas peculiares e muitos deles causam graves doenças em humanos, como a doença de Chagas, a doença do sono e a leishmaniose. Uma das formas de produzir fármacos para estas doenças depende da expressão de proteínas e da manipulação genética nestes protozoários. Pelo fato destes organismos serem patogênicos aos humanos é necessário adotar procedimentos de biossegurança, o que demanda um gasto maior de tempo para a manipulação. Para reduzir estas dificuldades, o tripanossomatídeo Angomonas deanei foi utilizado com o intuito de desenvolver um sistema de expressão heteróloga e de manipulação da expressão gênica eucariótica. Este organismo não apresenta risco de infecção a mamíferos, é capaz de ser cultivado em meio mínimo e produzir alta quantidade de biomassa e também pode realizar modificações pós-traducionais de proteínas alvo, como glicosilação. A possibilidade de usar A. deanei como ferramenta para manipulação gênica nos motivou a aprofundar na caracterização, por meio de análises in silico, dos potenciais componentes da maquinaria de RNA de interferência (RNAi) deste organismo. Duas prováveis proteínas dessa maquinaria foram encontradas: uma Ago (AdAGO) e uma PIWI (AdPIWI). Em ambas as proteínas foram identificados tanto o domínio PIWI quanto o PAZ, característicos de proteínas da via de RNAi. O domínio PAZ é bastante divergente em relação às proteínas AGO/PIWI de outros eucariotos. Uma provável tríade catalítica característica das proteínas argonautas foi identificada na proteína AdPIWI. Dada sua presença nos tripanossomatídeos sem RNAi funcional, é provável que a proteína AdPIWI exerça outro papel regulatório importante neste organismo. Semelhante ao encontrado em T. brucei, em AdAGO não foi encontrada a tríade catalítica. É provável que a AdAGO tenha um sítio catalítico distinto ou que atue recrutando outras proteínas para clivar o RNA. Para testar futuramente a funcionalidade da via de RNAi em A. deanei e também para usar este organismo como sistema de expressão, dois vetores utilizando sequências de A. deanei foram criados. Um deles para integração no locus de ?-tubulina (pCDXTub) e outro para integração no locus do RNA ribossômico (pCDXRibo). Dados de Southern blot de parasitos transfectados de forma estável indicaram a integração destes vetores no genoma. Contudo, os testes de expressão para os genes repórteres GFP e RLUC foram sem sucesso. Apesar de não detectar a fluorescência, parasitos carregando o vetor pCDXTub GFP foram capazes de produzir um transcrito compatível com o tamanho do mRNA de GFP e da resistência a neomicina. As razões para a não expressão dos genes repórteres são desconhecidas e necessitam de ensaios adicionais para elucidação desses resultados. Apesar dos dados não apontarem A. deanei como um bom modelo para expressão heteróloga, o vetor pCDXTub poderá ser usado no estudo da via de RNAi, devido à sua estabilidade e à capacidade de integração ao genoma desse protozoário. | - |
| Descrição: dc.description | Abstract: The Trypanosomatidae family comprises ancient parasitic protozoa with peculiar genetic features and many of them cause severe human diseases, such as Chagas disease, sleeping sickness, and leishmaniasis. One strategy to drug development against these diseases depends on protein expression and genetic manipulation in these protozoa. However, biosafety and time consuming methods are needed when manipulating these parasites, since some of them are pathogenic to humans. In order to reduce these difficulties, the trypanosomatid Angomonas deanei was used with the intention of developing tools for heterologous expression and gene manipulation. This protozoan grows in minimal medium (without fetal calf serum) to high cell density and represents no risk of infection for mammals, and it is also able to realize posttranslational modification of target proteins, such as glycosylation. The possibility of using A. deanei as a model for genetic manipulation prompted us to further characterization of the potential components of the RNA interference (RNAi) machinery in this organism by in silico analysis. Two putative proteins of this machinery were found: AGO (AdAGO) and PIWI (AdPIWI). The characteristic domains of RNAi proteins such as PIWI and PAZ domains were identified, however the PAZ domain in these proteins shares low homology with AGO/PIWI proteins from other eukaryotes. A putative catalitic triad common in argonautes was identified only in AdPIWI protein. Since AdPIWI orthologues are present in trypanosomatid protozoa with no functional RNAi machinery, it's likely that the AdPIWI protein plays a role in other regulatory process in this organism. As described for Trypanosoma brucei ortholog, the catalytic triad wasn't identified in AdAGO protein. It's possible that AdAGO has a different catalytic site or is capable to recruit other proteins with RNA slicer activity. For future experimental characterization of RNAi phenomenon, and also to use this organism as a protein expression system, two expression vectors were constructed. One of them for integration in the ?-tubulin locus (pCDXTub) and the other one to integrate into the rDNA locus. The southern blot data of stable transfected parasites indicate that both vectors can integrate in A. deanei genome, however, expression assays for the reporter genes GFP and luciferase failed to show any activity. Despite the lack of fluorescence detection, cells carrying the pCDXTub vector were able to express a transcript compatible with GFP and neomycin resistance mature mRNAs. The reasons for the lack reporter genes expression are unknown and require additional tests to elucidate these results. Although the data do not suggest that A. deanei is a proper model for protein expression, it's possible that pCDXTub vector can be used for the experimental test of RNAi pathway, because of its stability and ability to integrate this protozoan's genome. | - |
| Formato: dc.format | 107f. : il. [algumas colors.], grafs., tabs. | - |
| Formato: dc.format | application/pdf | - |
| Formato: dc.format | application/pdf | - |
| Relação: dc.relation | Disponível em formato digital | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Teses | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Tripanossomo | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Ácido ribonucleico | - |
| Palavras-chave: dc.subject | Bioquímica | - |
| Título: dc.title | Construção e avaliação de vetores de expressão heteróloga em Angomonas deanei | - |
| Tipo de arquivo: dc.type | livro digital | - |
| Aparece nas coleções: | Repositório Institucional - Rede Paraná Acervo | |
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