Caracterização bioquímica das proteínas RecA e RecX de Herbaspirillum seropedicae

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Autor(es): dc.contributorSteffens, Maria Berenice Reynaud-
Autor(es): dc.contributorChubatsu, Leda Satie, 1966--
Autor(es): dc.contributorUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)-
Autor(es): dc.creatorGalvao, Carolina Weigert-
Data de aceite: dc.date.accessioned2019-08-21T23:08:52Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2019-08-21T23:08:52Z-
Data de envio: dc.date.issued2019-02-27-
Data de envio: dc.date.issued2019-02-27-
Data de envio: dc.date.issued2005-
Fonte completa do material: dc.identifierhttps://hdl.handle.net/1884/1967-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/1884/1967-
Descrição: dc.descriptionOrientadora : Maria Berenice Reynaud Steffens-
Descrição: dc.descriptionCo-orientadora : Leda Satie Chubatsu-
Descrição: dc.descriptionTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduaçâo em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005-
Descrição: dc.descriptionInclui bibliografia-
Descrição: dc.descriptionResumo: O reparo do DNA é um mecanismo essencial para a sobrevivência de todos os organismos, desde as formas de vida unicelulares até humanos. A proteína RecA bacteriana é um componente central no reparo de DNA pois induz indiretamente a expressão de proteínas envolvidas no reparo não mutagênico e mutagênico do DNA, reparo SOS e reparo por recombinação. RecX é uma proteína moduladora da atividade de RecA, mas o mecanismo ainda não é conhecido. Os genes recA e recX de Herbaspirillum seropedicae formam um único operon e as evidências indicam que RecX participa no reparo SOS, possivelmente modulando as atividades de RecA. Para determinar o envolvimento da proteína RecX na regulação das atividades de RecA, as proteínas RecA, RecA mutante L54Q ou L54Q G73A e RecX de H. seropedicae foram superexpressas em E. coli, purificadas nas suas formas nativas e/ou com cauda de resíduos de histina (His) e caracterizadas in vitro. A interação entre as proteínas RecA e RecX de H. seropedicae (HsRecA e HsRecX) foi demonstrada através de ensaios de imobilização em resina de sepharose e eletroforese em duas dimensões. Ensaios de retardamento de migração eletroforética do DNA revelaram que as proteínas HsRecA e HsRecX são capazes de se ligar ao DNA de fita dupla e simples na ausência de ATP. HsRecX liga-se ao DNA fita dupla mesmo na presença de HsRecA. HsRecA também apresentou as atividades de ligação ao ATP, hidrólise de ATP e troca de fitas de DNA. A proteína HsRecX inibiu 90% da atividade de troca de fitas de HsRecA quando presente numa concentração molar 50 vezes menor do que HsRecA. A ligação do ATP à HsRecA não foi afetada pela presença de HsRecX porém a atividade ATPásica foi reduzida. Quando a proteína HsRecX estava presente antes da formação do filamento de RecA (HsRecA-ssDNA), a inibição dessa atividade ATPásica foi substancialmente reduzida, enquanto excesso de ssDNA suprimiu parcialmente essa inibição. A substituição do resíduo L54 por Q provocou uma redução na atividade de ligação ao DNA. Além disso, embora esta proteína mutada ainda ligue ATP, não foi capaz de hidrolisá-lo ou realizar troca de fitas de DNA, sugerindo que o resíduo L54 está envolvido nesses processos. Estes resultados sugerem que a proteína HsRecX modula a atividade de HsRecA através de interações HsRecA-HsRecX e possivelmente controla a disponibilidade de DNA substrato de RecA.-
Descrição: dc.descriptionAbstract: DNA repair is crucial to the survival of all organisms from unicellular life forms to humans. The bacterial RecA protein is a central component in DNA repair as it induces indirectly the expression of proteins involved in non-mutagenic and mutagenic DNA repair, SOS repair and recombination repair. RecX is a modulator protein of RecA activity, but the mechanism of control remains unknown. The recA and recX genes of Herbaspirillum seropedicae constitute a single operon, and evidences suggest that RecX participates in SOS repair, probably modulating RecA activities. To determine the involvement of RecX in the regulation of RecA activities, RecA wild-type, RecA mutant L54Q or L54Q G73A and RecX proteins of H. seropedicae were overexpressed and purified either in native or His-tagged (His) form and characterized in vitro. The interaction between the RecA and RecX proteins of H. seropedicae (HsRecA and HsRecX) was demonstrated by sepharose bead immobilization and two dimensional electrophoresis. DNA band-shift assays revealed that both HsRecX and HsRecA proteins bound to single-stranded DNA (ssDNA) and also double-stranded DNA (dsDNA) in the absence of ATP. The HsRecX bound to DNA even in the presence of HsRecA. HsRecA also possessed ATP binding, ATP hydrolysis and DNA strand exchange activities. The HsRecX inhibited 90% of the HsRecA DNA strand exchange activity even when present in a 50 times less molar concentration than HsRecA. ATP binding to HsRecA was not affected by the addition of RecX, but the ATPase activity was reduced. Under conditions where HsRecX was present prior to the formation of RecA filaments (RecA-ssDNA), the inhibition was substantially reduced, and excess of ssDNA partially suppressed this inhibition. The substitution of the L54 residue by Q decreased HsRecA DNA binding activity. In addition, although the mutant protein still binds ATP, it was not able to hydrolyze it nor to exchange DNA strands, suggesting that the L54 residue is involved in these processes. The results suggest that the HsRecX protein modulates HsRecA activities by HsRecA-HsRecX interactions and probably controls the availability of the DNA substrate of RecA.-
Formato: dc.format161f. : il. algumas color.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
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Relação: dc.relationDisponível em formato digital-
Palavras-chave: dc.subjectTeses-
Palavras-chave: dc.subjectBioquímica-
Palavras-chave: dc.subjectProteínas-
Título: dc.titleCaracterização bioquímica das proteínas RecA e RecX de Herbaspirillum seropedicae-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
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