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Metadados | Descrição | Idioma |
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Autor(es): dc.contributor | Mitchell, David Alexander | - |
Autor(es): dc.contributor | Souza, Emanuel Maltempi de, 1964- | - |
Autor(es): dc.contributor | Kriger, Nadia | - |
Autor(es): dc.contributor | Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica) | - |
Autor(es): dc.creator | Santos, Marcelo Muller dos | - |
Data de aceite: dc.date.accessioned | 2019-08-21T22:57:54Z | - |
Data de disponibilização: dc.date.available | 2019-08-21T22:57:54Z | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2019-02-28 | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2019-02-28 | - |
Data de envio: dc.date.issued | 2005 | - |
Fonte completa do material: dc.identifier | https://hdl.handle.net/1884/1952 | - |
Fonte: dc.identifier.uri | http://educapes.capes.gov.br/handle/1884/1952 | - |
Descrição: dc.description | Orientador : David Alexander Mitchell | - |
Descrição: dc.description | Co-orientadores : Emanuel Maltempi de Souza e Nadia Kriger | - |
Descrição: dc.description | Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005 | - |
Descrição: dc.description | Inclui bibliografia | - |
Descrição: dc.description | As lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-itrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999). | - |
Descrição: dc.description | Resumo: As lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-nitrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999). | - |
Formato: dc.format | 120f. : il. | - |
Formato: dc.format | application/pdf | - |
Formato: dc.format | application/pdf | - |
Relação: dc.relation | Disponível em formato digital | - |
Palavras-chave: dc.subject | Teses | - |
Palavras-chave: dc.subject | Bioquímica | - |
Palavras-chave: dc.subject | Lipase | - |
Título: dc.title | Utilização de mutagenese aleatória para obtenção da lipase de Burkholria cepacia com variação nas propriedades catalíticas | - |
Tipo de arquivo: dc.type | livro digital | - |
Aparece nas coleções: | Repositório Institucional - Rede Paraná Acervo |
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