Utilização de mutagenese aleatória para obtenção da lipase de Burkholria cepacia com variação nas propriedades catalíticas

Registro completo de metadados
MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorMitchell, David Alexander-
Autor(es): dc.contributorSouza, Emanuel Maltempi de, 1964--
Autor(es): dc.contributorKriger, Nadia-
Autor(es): dc.contributorUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)-
Autor(es): dc.creatorSantos, Marcelo Muller dos-
Data de aceite: dc.date.accessioned2019-08-21T22:57:54Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2019-08-21T22:57:54Z-
Data de envio: dc.date.issued2019-02-28-
Data de envio: dc.date.issued2019-02-28-
Data de envio: dc.date.issued2005-
Fonte completa do material: dc.identifierhttps://hdl.handle.net/1884/1952-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/1884/1952-
Descrição: dc.descriptionOrientador : David Alexander Mitchell-
Descrição: dc.descriptionCo-orientadores : Emanuel Maltempi de Souza e Nadia Kriger-
Descrição: dc.descriptionDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005-
Descrição: dc.descriptionInclui bibliografia-
Descrição: dc.descriptionAs lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-itrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999).-
Descrição: dc.descriptionResumo: As lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-nitrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999).-
Formato: dc.format120f. : il.-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Relação: dc.relationDisponível em formato digital-
Palavras-chave: dc.subjectTeses-
Palavras-chave: dc.subjectBioquímica-
Palavras-chave: dc.subjectLipase-
Título: dc.titleUtilização de mutagenese aleatória para obtenção da lipase de Burkholria cepacia com variação nas propriedades catalíticas-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional - Rede Paraná Acervo

Não existem arquivos associados a este item.