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Efeito antibiofilme e citotoxicidade de Zingiber zerumbet associado à terapia fotodinâmica em biofilmes de Candida albicans

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MetadadosDescriçãoIdioma
Autor(es): dc.contributorPavarina, Ana Claudia-
Autor(es): dc.contributorUniversidade Estadual Paulista (UNESP)-
Autor(es): dc.creatorPereira, César Augusto Abreu-
Data de aceite: dc.date.accessioned2025-08-21T20:59:10Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2025-08-21T20:59:10Z-
Data de envio: dc.date.issued2025-08-15-
Data de envio: dc.date.issued2025-07-25-
Fonte completa do material: dc.identifierhttps://hdl.handle.net/11449/312940-
Fonte completa do material: dc.identifierhttps://orcid.org/0000-0003-0665-906-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/11449/312940-
Descrição: dc.descriptionO objetivo desta tese foi avaliar a atividade antibiofilme e a biocompatibilidade da Zerumbona (ZER) combinada com a Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFD) sobre biofilmes de C. albicans suscetíveis (CaS; ATCC 90028), resistentes ao fluconazol (CaR; ATCC 96901; isolados clínicos resistentes HIV+ - R14 e R70), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922). Para isso, foram realizados quatro estudos: 1- foram determinadas a concentração inibitória mínima (CIM), a concentração fungicida mínima (CFM) do ZER e a curva de sobrevivência (CS) de CaS e CaR na presença do ZER. Além disso, biofilmes de 48 h foram expostos ao ZER (128 e 256 μg/mL) por 5, 10 e 20 min (n=12). Como controle, um grupo não recebeu tratamento; 2- o ZER (256µg/mL), o Photodithazine® [PDZ (P); 200 mg/L] e a luz LED [(L); 660nm; 50 J/cm2] foram utilizados no tratamento de biofilmes de isolados clínicos (CaS, CaR, R14 e R70), de forma isolada ou em associação, originando 8 grupos de tratamento (P+L+, P-L+, P+L-, P-L-, ZER+P-L-, ZER+P+L+, ZER+P+L- e ZER+P-L+; n=12); 3- foram investigados o efeito antifúngico, a biocompatibilidade e a ação resposta inflamatória do ZER combinado à TFD usando um modelo de cocultura tridimensional (3D) infectado com CaS ou CaR). Para isso, tecidos de queratinócitos orais (NOK-si) e fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram tratados com ZER (256 ou 512 µg/mL) e TFD [PDZ (200 mg/L) e luz LED (660 nm; 50 J/cm²; 44,5 mW/cm²)], individualmente ou em combinação. Os controles foram Nistatina (250 µg/mL), meio de cultura (DMEM) e um controle de indução de morte celular (Triton 0,9%). 4- Investigou o uso TFD com uma mistura de ZER e PDZ para inativar biofilmes de bactérias (S. aureus e E. coli) e fungos (CaS e CaR). Biofilmes foram cultivados por 48 horas e submetidos tratamentos com: 1-ZER (256 µg/mL); 2-PDZ (200 µg/mL); 3-PDZ+LED; 4-ZER+PDZ+LED; 5- MIX (ZER+PDZ)+LED. O grupo controle não recebeu tratamento. Os parâmetros de irradiação utilizados foram: LED (660 nm, 50 J/cm², 30 mW/cm², 20 min). A segurança do tratamento foi avaliada testando sua toxicidade em modelo 2D de células orais (FGH e Nok-si). Análises de High-performance liquid chromarography (HPLC) e Espectrometria de Massas (ES) e Espectro de Absorbância (EA) foram realizadas para verificar se a mistura ZER+PDZ não sofreu alterações moleculares. Nos estudos 1 e 2, a eficácia dos tratamentos foi avaliada através da população microbiana (UFC/mL), quantificação das biomassas (total e insolúvel) e dos componentes da matriz extracelular (polissacarídeos solúveis em água (WSP), polissacarídeos solúveis em álcali (ASP), proteínas e DNA extracelular (eDNA). Os dados foram submetidos ao teste de variância ANOVA [two-way (estudo 1), three-way (estudo 2) e one-way (estudos 3 e 4)] e  de 5%. Portanto, ZER foi eficaz contra biofilmes de CaR e CaS e perturbou a matriz extracelular. No estudo 1, a CIM e o valor de MFC coincidiram para CaS (256 μg/mL) e CaR (128 μg/mL). ZER a 256 μg/mL reduziu a viabilidade celular em 38,51% para CaS e em 36,99% para CaR, também reduziu a biomassa total (57%), biomassa insolúvel (45%), WSP (65%), proteínas (18%) e eDNA (78%) de CaS. Para CaR observou-se a redução da biomassa insolúvel (13%), proteínas (18%), WSP (65%), ASP (10%) e eDNA (23%). No estudo 2, a associação de ZER com TFD provocou redução dos componentes do biofilme de todas as cepas avaliadas (CaS, CaR, R14 e R70). Em média, houve a redução da viabilidade celular em 2,01 log10 (30%), da biomassa total (30%) e insolúvel (33%) das proteínas totais (15%), além dos componentes da MEC: proteínas insolúveis (24%), WSP (68%), ASP (26%) e eDNA (60%). No estudo 3, em modelo de cocultura não infectado, o tratamento de ZER (256 µg/mL) + TFD exibiu baixa citotoxicidade por alamarBlueTM, com redução da viabilidade celular abaixo de 18%. No modelo 3D infectado, ZER (256 µg/mL) + aPDT resultou em um dano celular de 7,41% para CaS e 9,43% para o CaR, medido pela liberação de Lactato Desidrogenase (LDH). As reduções nas colônias viáveis do biofilme foram de 2,36 log₁₀ para CaS e 2,15 log₁₀ para CaR. Imagens por Microscopia Confocal de Varredura a Laser (CLSM) apoiaram esses achados, indicando que ZER + aPDT inibiu a penetração da infecção. Além disso, ZER combinado com TFD reduziu as respostas pró-inflamatórias (IL-6 e IL-8) induzidas pela infecção por C. albicans. No estudo 4, tanto o grupo ZER+PDZ+LED quanto o grupo MIX (ZER+PDZ)+LED mostraram a maior redução estatisticamente significativa em UFC/mL comparado ao controle (p≤0,011) em todas as cepas avaliadas, sem diferença significativa entre eles (p≥0,218). A redução observada foi de 2,74, 2,89, 2,45 e 2,07 log10 para S. aureus, E. coli, CaS e CaR, respectivamente. A redução da viabilidade celular em NOK-si e FGH não excedeu 17%. Análises de EA, HPLC e ES confirmaram que as características do PDZ permaneceram inalteradas ao ser misturado com ZER. O tratamento com ZER+TFD aumentou a eficácia do tratamento fotodinâmico contra CaS e CaR representando uma abordagem antifúngica promissora. Em modelos de cocultura 3D, o tratamento com ZER foi considerado não citotóxico. Análises de AS, HPLC e MS confirmaram que as características do PDZ permaneceram inalteradas ao ser misturado com ZER, reduzindo o tempo de aplicação e potencializando o efeito do tratamento fotodinâmico antimicrobiano independentemente das características da cepa (fúngica ou bacteriana). Portanto, a sua segurança e eficácia de ZER em combinação com TFD foi observada contra biofilmes de C. albicans, S. aureus e E. coli, sendo uma alternativa promissora para controle e inativação de biofilmes.-
Descrição: dc.descriptionThe aim of this thesis was to evaluate the antibiofilm activity and biocompatibility of Zerumbone (ZER) combined with Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) on biofilms of susceptible C. albicans (CaS; ATCC 90028), fluconazole-resistant C. albicans (CaR; ATCC 96901; resistant clinical isolates HIV+ - R14 and R70), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), and Escherichia coli (ATCC 25922). For this purpose, four studies were conducted: 1- the minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum fungicidal concentration (MFC) of ZER, and the survival curve (SC) of CaS and CaR in the presence of ZER were determined. In addition, 48-hour biofilms were exposed to ZER (128 and 256 μg/mL) for 5, 10, and 20 min (n=12). As a control, one group received no treatment; 2- ZER (256 μg/mL), Photodithazine® [PDZ (P); 200 mg/L] and LED light [(L); 660 nm; 50 J/cm²] were used in the treatment of biofilms of clinical isolates (CaS, CaR, R14, and R70), either alone or in association, resulting in 8 treatment groups (P+L+, P-L+, P+L-, P-L-, ZER+P-L-, ZER+P+L+, ZER+P+L- and ZER+P-L+; n=12); 3- the antifungal effect, biocompatibility, and inflammatory response action of ZER combined with aPDT were investigated using a three-dimensional (3D) co-culture model infected with CaS or CaR. For this, oral keratinocyte tissues (NOK-si) and human gingival fibroblasts (HGF) were treated with ZER (256 or 512 μg/mL) and aPDT [PDZ (200 mg/L) and LED light (660 nm; 50 J/cm²; 44.5 mW/cm²)], individually or in combination. The controls were Nystatin (250 μg/mL), culture medium (DMEM), and a cell death induction control (0.9% Triton). 4- the use of aPDT with a mixture of ZER and PDZ was investigated to inactivate biofilms of bacteria (S. aureus and E. coli) and fungi (CaS and CaR). Biofilms were cultured for 48 hours and subjected to treatments with: 1-ZER (256 μg/mL); 2-PDZ (200 μg/mL); 3-PDZ+LED; 4-ZER+PDZ+LED; 5- MIX (ZER+PDZ)+LED. The control group received no treatment. The irradiation parameters used were: LED (660 nm, 50 J/cm², 30 mW/cm², 20 min). The safety of the treatment was evaluated by testing its toxicity in a 2D oral cell model (HGF and Nok-si). Analyses of High-performance liquid chromatography (HPLC) and Mass Spectrometry (MS) and Absorbance Spectrum (AS) were performed to verify if the ZER+PDZ mixture did not undergo molecular alterations. In studies 1 and 2, the efficacy of the treatments was evaluated through the microbial population (CFU/mL), quantification of biomass (total and insoluble) and the components of the extracellular matrix (water-soluble polysaccharides (WSP), alkali-soluble polysaccharides (ASP), proteins, and extracellular DNA (eDNA)). The data were submitted to the ANOVA variance test [two-way (study 1), three-way (study 2) and one-way (studies 3 and 4)] with α of 5%. Therefore, ZER was effective against CaR and CaS biofilms and disrupted the extracellular matrix. In study 1, the MIC and MFC values coincided for CaS (256 μg/mL) and CaR (128 μg/mL). ZER at 256 μg/mL reduced cell viability by 38.51% for CaS and 36.99% for CaR, also reducing total biomass (57%), insoluble biomass (45%), WSP (65%), proteins (18%) and eDNA (78%) of CaS. For CaR, a reduction in insoluble biomass (13%), proteins (18%), WSP (65%), ASP (10%) and eDNA (23%) was observed. In study 2, the association of ZER with aPDT caused a reduction in the biofilm components of all evaluated strains (CaS, CaR, R14, and R70). On average, there was a reduction in cell viability of 2.01 log₁₀ (30%), total (30%) and insoluble (33%) biomass, total proteins (15%), as well as MEC components: insoluble proteins (24%), WSP (68%), ASP (26%) and eDNA (60%). In study 3, in an uninfected co-culture model, ZER (256 μg/mL) + aPDT treatment exhibited low cytotoxicity by alamarBlue™, with a reduction in cell viability below 18%. In the infected 3D model, ZER (256 μg/mL) + aPDT resulted in cell damage of 7.41% for CaS and 9.43% for CaR, measured by Lactate Dehydrogenase (LDH) release. The reductions in viable biofilm colonies were 2.36 log₁₀ for CaS and 2.15 log₁₀ for CaR. Images from a Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) supported these findings, indicating that ZER + aPDT inhibited the penetration of the infection. In addition, ZER combined with aPDT reduced the pro-inflammatory responses (IL-6 and IL-8) induced by C. albicansinfection. In study 4, both the ZER+PDZ+LED group and the MIX (ZER+PDZ)+LED group showed the most statistically significant reduction in CFU/mL compared to the control (p≤0.011) in all strains evaluated, with no significant difference between them (p≥0.218). The observed reduction was 2.74, 2.89, 2.45, and 2.07 log₁₀ for S. aureus, E. coli, CaS, and CaR, respectively. The reduction in cell viability in NOK-si and HGF did not exceed 17%. AS, HPLC, and MS analyses confirmed that the characteristics of PDZ remained unchanged when mixed with ZER. Treatment with ZER+aPDT increased the efficacy of photodynamic treatment against CaS and CaR, representing a promising antifungal approach. In 3D co-culture models, ZER treatment was considered non-cytotoxic. AS, HPLC, and MS analyses confirmed that the characteristics of PDZ remained unchanged when mixed with ZER, reducing application time and enhancing the effect of antimicrobial photodynamic treatment regardless of the characteristics of the strain (fungal or bacterial). Therefore, the safety and efficacy of ZER in combination with aPDT were observed against biofilms of C. albicans, S. aureus, and E. coli, making it a promising alternative for biofilm control and inactivation.-
Descrição: dc.descriptionFundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico do Maranhão (FAPEMA)-
Descrição: dc.descriptionFAPEMA: 190480/2021-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Formato: dc.formatapplication/pdf-
Idioma: dc.languagept_BR-
Publicador: dc.publisherUniversidade Estadual Paulista (UNESP)-
Direitos: dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/restrictedAccess-
Palavras-chave: dc.subjectBiofilmes-
Palavras-chave: dc.subjectCandida albicans-
Palavras-chave: dc.subjectEscherichia coli-
Palavras-chave: dc.subjectFotoquimioterapia-
Palavras-chave: dc.subjectSesquiterpenos monocíclicos-
Palavras-chave: dc.subjectStaphylococcus aureus-
Palavras-chave: dc.subjectBiofilms-
Palavras-chave: dc.subjectCandida albicans-
Palavras-chave: dc.subjectEscherichia coli-
Palavras-chave: dc.subjectPhotochemotherapy-
Palavras-chave: dc.subjectMonocyclic sesquiterpenes-
Palavras-chave: dc.subjectStaphylococcus aureus-
Título: dc.titleEfeito antibiofilme e citotoxicidade de Zingiber zerumbet associado à terapia fotodinâmica em biofilmes de Candida albicans-
Título: dc.titleAntibiofilm effect and cytotoxicity of Zingiber zerumbet associated with photodynamic therapy in Candida albicans biofilms-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional - Unesp

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