Influência do peróxido de hidrogênio na formação e virulência de biofilmes de Streptococcus mutans

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Autor(es): dc.contributorUniversidade Estadual Paulista (UNESP)-
Autor(es): dc.creatorZenaro, Paula Pereira-
Data de aceite: dc.date.accessioned2021-03-10T23:30:59Z-
Data de disponibilização: dc.date.available2021-03-10T23:30:59Z-
Data de envio: dc.date.issued2018-05-24-
Data de envio: dc.date.issued2018-05-24-
Data de envio: dc.date.issued2018-03-26-
Fonte completa do material: dc.identifierhttp://hdl.handle.net/11449/154080-
Fonte: dc.identifier.urihttp://educapes.capes.gov.br/handle/11449/154080-
Descrição: dc.descriptionCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)-
Descrição: dc.descriptionPós-graduação em Ciências Odontológicas - FOAR-
Descrição: dc.descriptionO peróxido de hidrogênio (H2O2) é considerado uma das principais fontes endógenas de estresse oxidativo para bactérias orais. Contudo, o seu papel no processo de desenvolvimento da cárie dentária ainda não está completamente elucidado. O objetivo deste estudo in vitro foi gerar uma cepa de Streptococcus mutans tolerante ao H2O2, e avaliar a habilidade do H2O2 em afetar a formação e a virulência de biofilmes de S. mutans. Para gerar a cepa tolerante ao H2O2, a cepa de S. mutans UA159, foi reativada em placas de agar BHI e incubadas (48 horas, a 37°C e 5% de CO2). Duas a cinco colônias foram transferidas para tubos falcon contendo 2 mL de caldo BHI suplementado com 1% de glicose e incubadas por 18 horas, sob as mesmas condições. As culturas foram diluídas 1:20 em meio de cultura fresco, incubadas até atingirem a fase exponencial de crescimento, centrifugadas, lavadas, ressuspensas em glicina, e submetidas a tratamento com 80 mM de H2O2. Esses procedimentos foram repetidos por oito vezes, e as colônias sobreviventes foram consideradas tolerantes. Em seguida, para o crescimento do biofilme, foi usado um modelo de aderência ativa. Lamínulas de vidro estéreis, jateadas com óxido de alumínio, foram imersas em saliva filtrada para a formação da película adquirida. Posteriormente, foram imersas verticalmente em 2,8 mL de caldo BHI com 1% de sacarose (n=12 por grupo) inoculado com 106 UFC/mL da cepa controle (grupo GC) ou da cepa tolerante ao H2O2. Para a cepa tolerante ao H2O2, em um grupo (grupo GTcPH) foram acrescentados 80 mM de H2O2 ao meio de cultura e, no outro (grupo GTsPH), os micro-organismos cresceram em meio de cultura semelhante ao do grupo GC. As placas foram incubadas a 37°C com 5% de CO2 por 5 dias e o meio de cultura foi renovado diariamente. Em seguida, a suspensão bacteriana obtida dos biofilmes foi usada para a contagem de micro-organismos, dosagem de polissacarídeos insolúveis em água e quantificação de proteína total. O meio de cultura foi usado para avaliação do pH e da concentração de ácido lático. Os dados de contagem de micro-organismos do biofilme, os valores de pH do meio e a concentração de ácido lático foram analisados pelo teste ANOVA com correção de Welch, seguido do pós teste de Games-Howell para dados heterocedásticos. Para o peso seco do biofilme, concentração de proteínas e quantificação de polissacarídeos extracelulares insolúveis em água, foram analisados apenas os grupos GC e GTsPH. No grupo GTcPH o biofilme formado foi insuficiente para a realização dessas análises. A distribuição dos dados foi normal e houve homogeneidade de variâncias, sendo aplicado o teste t de Student. O nível de significância estabelecido para todos os testes foi de 5%. A contagem de UFC no biofilme foi significativamente menor apenas no grupo GTcPH (p<0,001). Este grupo mostrou valores de pH significativamente maiores que os grupos GC e GTsPH (p<0,001). A concentração de ácido lático foi maior em GC, seguido pelos grupos GTsPH e GTcPH, tendo o último produzido a menor quantidade do ácido lático (p<0,001). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos GC e GTsPH para peso seco do biofilme e concentração de proteínas (p≥0,051). A concentração de polissacarídeos extracelulares insolúveis em água foi significativamente maior no grupo GC em relação ao grupo GTsPH (p=0,040). Baseado nos resultados obtidos, pode-se concluir que a cepa tolerante ao H2O2 apresentou uma diminuição na expressão de fatores de virulência quando cultivada tanto na presença quanto na ausência do H2O2.-
Descrição: dc.descriptionHydrogen peroxide (H2O2) is one of the main endogenous sources of oxidative stress for oral bacteria. However, its role in the dental caries development has not been fully elucidated. The objective of this in vitro study was to generate a strain of S. mutans tolerant to H2O2, and to evaluate the ability of H2O2 to affect the biofilm formation and virulence of S. mutans. To generate the H2O2 tolerant strain, S. mutans UA159 was reactivated on BHI agar plates, and incubated (48 hours at 37 oC and 5% CO2). Two to five colonies of the microorganism were transferred to falcon tubes containing 2 mL of BHI broth supplemented with 0.8% glucose and incubated under the same conditions for 18 hours. The culture was diluted 1:20 in fresh culture medium, incubated again until reaching the mind-log growth phase, centrifuged, washed, suspended in glycine, and treated with 80 mM H2O2. These procedures were repeated for eight times, and then the surviving colonies were considered tolerant. Next, the biofilm were grown on glass slides using an active adherence model. First, sterile glass slides, sandblasted with aluminum oxide, were immersed in filtered saliva to form the acquired pellicle. After that, the slides were immersed vertically in 2.8 mL of BHI broth with 1% sucrose (n = 12 per group) and inoculated with 106 CFU/mL of the control strain (GC Group) or H2O2 tolerant strain. For the H2O2 tolerant strain, in a group (GTcPH group) 80 mM H2O2 were added in the culture medium and in the other group (GTsPH group) microorganisms grown in culture medium similar to that used for the GC group. The plates were incubated (37 oC, 5% CO2) for five days and the culture medium was renewed daily. Then, the suspension of bacteria obtained from the biofilm was used for microorganisms counting, dosing of water insoluble extracellular polysaccharides, dry-weight, CFU and total protein. The culture medium was used to evaluate pH and lactic acid concentration. The CFU counts, pH of the medium and lactic acid concentration were analyzed by ANOVA with Welch correction, followed by Games-Howell post-test for heterocedastic data. For biofilm dry weight, protein concentration and quantification of water insoluble extracellular polysaccharides, only GC and GTsPH were analyzed. In GTcPH group, the biofilm formed was insufficient to perform these analyzes. Data distribution was normal and there were homogeneity of variances, so Student's t-test was applied. The significance level established for all tests was 5%. CFU counts in the biofilm were significantly lower in the GTcPH group (p<0.001). This group showed significantly higher pH values than the GC and GTsPH groups (p<0.001). The lactic acid concentration was higher in GC, followed by GTsPH and GTcPH, the latter group having produced the lowest amount of lactic acid (p <0.001). There was no statistically significant difference between the GC and GTsPH groups for dry weight of the biofilm and protein concentration (p≥0.051). The concentration of water insoluble extracellular polysaccharides was significantly higher in CG than in GTsPH (p=0.040).Therefore the hydrogen peroxide tolerant strain showed a decrease in the expression of virulence factors when cultivated both in the presence and in absence of hydrogen peroxide.-
Idioma: dc.languagept_BR-
Publicador: dc.publisherUniversidade Estadual Paulista (UNESP)-
Direitos: dc.rightsopenAccess-
Palavras-chave: dc.subjectPeróxido de hidrogênio-
Palavras-chave: dc.subjectStreptococcus mutans-
Palavras-chave: dc.subjectBiofilmes-
Palavras-chave: dc.subjectFatores de virulência-
Palavras-chave: dc.subjectHydrogen peroxide-
Palavras-chave: dc.subjectStreptococcus mutans-
Palavras-chave: dc.subjectBiofilms-
Palavras-chave: dc.subjectVirulence factors-
Título: dc.titleInfluência do peróxido de hidrogênio na formação e virulência de biofilmes de Streptococcus mutans-
Tipo de arquivo: dc.typelivro digital-
Aparece nas coleções:Repositório Institucional - Unesp

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